摘要：建立HPLC測(cè)定馬甲子1#含量的方法，采用BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6mmxlOOmmx2.4μm），以乙腈-O.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.OmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。結(jié)果表明馬甲子1#在0.0214-0.8544μg（r=0.9999）范圍進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.4%（RSD=1.18%）。該方法快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于測(cè)定馬甲子中馬甲子1#的含量。
　　關(guān)鍵詞：馬甲子；馬甲子l#；高效液相色譜法（HPLC）；含量測(cè)定
　　文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A
　　文章編號(hào)：1674-5124（2015）04-0043-03
　　0 引言
　　馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir系鼠李科銅錢(qián)屬植物，又名鐵籬笆、銅錢(qián)樹(shù)。其根部具有發(fā)表解熱，祛風(fēng)利濕，治跌打損傷及心腹疼痛的功能，其葉具有治癰瘡潰瘍作用。經(jīng)本課題組的前期研究證實(shí)其葉也具有抗腫瘤作用且療效較好。為了探索馬甲子葉中的相關(guān)活性成分，本文對(duì)馬甲子葉中的某些戍分進(jìn)行了提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤等方面的研究，得到了新的活性單體馬甲子l#，為了進(jìn)一步研究該成分，制定了本文的含量測(cè)定方法。
　　1 實(shí)驗(yàn)部分
　　1.1 儀器與試藥
　　1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；SartoriusBS2IOS電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。
　　乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；水（樂(lè)百氏純凈水）；甲酸、甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。
　　藥材：于2013年6月采自四川省牧馬山的鮮葉，經(jīng)鑒定為鼠李科銅錢(qián)屬植物馬甲子Paliurus ramo-sissimus（Lour.）Poir.，冷凍干燥備用；馬甲子l#對(duì)照品（成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：14070109），純度經(jīng)歸一化法測(cè)定為97.4%。馬甲子1#經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，屬于新化合物，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖l。
　　1.2 方法與結(jié)果
　　1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
　　色譜柱為BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6mmX100 mmx2.4μm，Thermo Fisher Scientific）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按表l進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL。理論塔板數(shù)按馬甲子1#計(jì)算應(yīng)不低于3000。分別選擇乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，考察不同流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)樣品的分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)時(shí)主峰與雜質(zhì)峰分離較好，且分離度>1.5，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)。在小范圍內(nèi)改變進(jìn)樣體積、柱溫及流速，色譜圖無(wú)明顯變化。對(duì)照品和供試品溶液的色譜圖分別見(jiàn)圖2（a）和圖2（b）。
　　1.2.2 樣品的制備
　　精密稱取馬甲子1#對(duì)照品適量，用甲醇制成含馬甲子1#0.1068mg/mL的對(duì)照品貯備液。分析測(cè)試中所用對(duì)照品溶液由對(duì)照品貯備液稀釋得到。
　　取馬甲子藥材粉末（過(guò)4號(hào)篩）約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50mL，稱定質(zhì)量，回流提取2h后，取出，冷卻，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。
　　1.2.3 線性范圍考察
　　分別精密移取馬甲子l#對(duì)照品貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，8.0mL置于lOmL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定馬甲子1#的峰面積，并以進(jìn)樣量對(duì)其峰面積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y_馬甲子1#=2.396x10³X-4.758（r=0.9999）。結(jié)果表明馬甲子1#在0.0214-0.8544μg范圍進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)圖3。
　　1.2.4 精密度試驗(yàn)
　　取含馬甲子1#0.02136mg/mL的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算馬甲子1#峰面積的RSD為0.73%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。
　　1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)
　　取同一批號(hào)的馬甲子藥材粉末（過(guò)4號(hào)篩）6份，按“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算馬甲子1#含量的RSD為0.70%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。
　　1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
　　取同一對(duì)照品溶液，于室溫下0，2，4，6，8，12，24h分別進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算馬甲子1#的RSD為1.05%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
　　1.2.7 加樣回收率試驗(yàn)
　　稱取已測(cè)定含量的馬甲子藥材粉末（過(guò)4號(hào)篩）約2.5 9，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共6份，分別精密加入對(duì)照品貯備液SmL，精密加入95%乙醇50mL，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果表明回收率較好（見(jiàn)表2）。
　　1.2.8 樣品測(cè)定
　　在本文色譜條件下，被測(cè)成分與其他化合物色譜峰分離度均良好。對(duì)10批馬甲子藥材進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。
　　2 討論
　　馬甲子藥材中馬甲子l#含量的測(cè)定試驗(yàn)，通過(guò)前期單因素試驗(yàn)考察了馬甲子1#的提取工藝，并從操作便捷性和節(jié)約資源等方面綜合考慮最終確定了供試品溶液的制備方法。用本文色譜條件測(cè)定10批馬甲子藥材中馬甲子1#的含量，其中批號(hào)140523的藥材中馬甲子1#含量最高，同時(shí)該批次馬甲子藥材抗腫瘤活性最強(qiáng)，由此進(jìn)一步確定其為馬甲子藥材抗腫瘤活性成分之一。馬甲子l#含量的測(cè)定能夠初步評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地、不同采收期馬甲子藥材的質(zhì)量，為民間癌癥患者用藥提供了一定的參考。
　　3 結(jié)束語(yǔ)
　　目前對(duì)馬甲子的研究主要集中在其根、莖、果實(shí)中化學(xué)成分的分離鑒定，而馬甲子葉中化學(xué)成分的研究未見(jiàn)報(bào)道。馬甲子l#屬于從馬甲子葉中分離得到具有門(mén)樺酸母核的新的五環(huán)三萜類化合物，具有一定的抗腫瘤活性，有較好的研究前景。本文所建立的HPLC法能有效地將馬甲子藥材中馬甲子l#與其他成分分開(kāi)，分離度>1.5，且峰形較好，分析時(shí)間短，為馬甲子1#定量分析提供了參考，為后期的深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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