[摘要]該研究從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)角度研究新疆維吾爾醫(yī)常用藥材沙棗的基原是否為胡頹子屬3種沙棗。隨機選擇不同產(chǎn)地3種沙棗的葉片、花、果實，通過形態(tài)學(xué)比較外觀差異；使用DNA條形碼ITS2序列對新疆3種17份沙棗ITS2序列進行PCR擴增和測序，比較17份樣品ITS2序列種內(nèi)和種間變異、采用NJ樹法及ML法對其親緣關(guān)系進行分析，結(jié)果表明新疆胡頹子屬3種沙棗葉片、花、果實均無明顯區(qū)別特征，肉眼不易區(qū)分；沙棗、尖果沙棗、東方沙棗ITS2序列長度變化范圍為220～223 bp，平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.9%，單倍型數(shù)分別為4，3，3，NJ樹及ML樹均不能將三者區(qū)分。因此，從分子生物學(xué)角度看，新疆胡頹子屬3種沙棗可能為同一起源，均可作為維吾爾藥材沙棗的基原植物，但需進一步結(jié)合其分布、化學(xué)成分和藥理藥效等因素進行綜合深入的研究。
　　[關(guān)鍵詞]DNA條形碼；ITS2；沙棗；鑒定；基原植物
　　沙棗是胡頹子科Elaeagnaceae胡頹子屬Elaeagnus植物，主要分布在我國新疆和內(nèi)蒙古西部，其樹皮、枝葉、花、果等皆為維吾爾醫(yī)常用藥材，果實可治療頭痛、熱性咳嗽、腹瀉等^[1]；樹皮具有清熱涼血、收斂止痛的功效^[2]；花可治療慢性支氣管炎^[3]�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，藥材沙棗具有促進傷口愈合^[4]、抗菌殺蟲^[5]、鎮(zhèn)痛^[6-7]和松弛肌肉^[8]等功效。除此之外，沙棗樹還具有抗風(fēng)沙、耐鹽漬、耐干旱的特質(zhì)，是防風(fēng)固沙、開荒造田的首選林木，是集多種功能為一體的經(jīng)濟型樹種。我國分布的胡頹子屬沙棗的種類不多，但存在爭議，《中國植物志》和《新疆植物志》中收載了沙棗E. angustifolia、尖果沙棗E. oxycarpa及東方沙棗E. angustifolia var. orientalis（變種）^[9-10]，《中國沙漠植物志》還收錄了大果沙棗E. moorcroftii^[11]。沙棗采用經(jīng)典植物分類鑒定方法定種困難，需要同時依據(jù)花期及果期特征，常常同份標(biāo)本鑒定出不同結(jié)果。黃俊華等^[12]采用定株標(biāo)記采集、花果同時比較的方法，結(jié)合多份標(biāo)本，根據(jù)葉、花和果實特征，將新疆沙棗分為3種1變種；于瑋瑋等^[13]對大果沙棗和尖果沙棗的染色體核型進行分析，結(jié)果顯示，雖然兩者染色體結(jié)構(gòu)存在細(xì)微差別，但起源和演化中存在一定的親緣關(guān)系�！吨腥A人民共和國藥品標(biāo)準(zhǔn)（維藥分冊）》藥材“沙棗”僅收載了沙棗E. angustifolia^[14]，而新疆傳統(tǒng)習(xí)慣以沙棗、尖果沙棗及東方沙棗藥用為主，大果沙棗食用為主[1，15]。因此，研究和明確維吾爾藥材沙棗的基原植物，對實現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化具有重要的意義。
　　目前維吾爾藥材沙棗的相關(guān)研究多集中在形態(tài)和化學(xué)成分比較等方面，相關(guān)種源鑒定鮮見報道。DNA條形碼研究已成為近年來生物分類學(xué)研究的熱點和前沿，它是一種利用基因組中一段通用的標(biāo)準(zhǔn)短序列來進行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)^[16]，通過建立生物DNA條形碼系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動化的物種鑒定。陳士林研究團隊證明：ITS2序列可以作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼鑒別藥用植物及其近緣物種^[17-20]，并以ITS2序列為基礎(chǔ)初步建立了藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò)查詢系統(tǒng)。2011年，中國植物條形碼工作組（Chinese Plant BOL Group）建議將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心DNA條形碼^[21]。本研究采用此方法研究新疆胡頹子屬植物，旨在明確維吾爾藥材沙棗的植物基原，為維吾爾藥材的標(biāo)準(zhǔn)化提供科學(xué)的依據(jù)與方法。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　3種沙棗樣品包括葉片、花、果實采自新疆各地，DNA條形碼實驗材料按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則采集，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，同時以胡頹子科植物沙棘作為外類群進行研究。憑證標(biāo)本保存于新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本館（新疆XTNM），實驗所獲得的序列已提交至GenBank，詳見表1。
　　PCR擴增所用引物ITS2序列由生工生物工程合成，其正向序列為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向序列為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生物。
　　實驗所使用的DNA提取研磨儀為GRINDER，型號GT-100；離心機為上海安亭科學(xué)儀器，型號Anker TGL-16C；PCR擴增儀為An Analytik Jena company，型號070-851。
　　1.2 方法
　　1.2.1 3種沙棗外觀形態(tài)比較 隨機選擇不同產(chǎn)地3種沙棗的葉片、花、果實，測定葉片長寬、果實大小及形狀等進行形態(tài)學(xué)比較。
　　1.2.2 DNA的提取及檢測 稱取干燥葉片30 mg、果實25 mg，使用DNA提取研磨儀1 000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小及質(zhì)量。
　　1.2.3 PCR擴增及測序^[22] 反應(yīng)體積25 μL，包括dNTP 0.4 μL（10 mmol·L-1），PCR緩沖液2.5 μL（10×），引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1），聚合酶1.0 U，總DNA 1 μL（約30 ng）；擴增程序：94 ℃，變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40個循環(huán)）；72 ℃延伸10 min；擴增結(jié)果由美吉生物測序公司雙向測序。
　　1.2.4 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖用CodonCode Aligner V 4.0.4（CodonCode Co.，USA）校對拼接，去除引物區(qū)。將所有序列由軟件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比對^[23]，ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列^[24]，基于K2P模型分析種內(nèi)變異和種間變異[16，25]。用鄰接（NJ）法及最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，使用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗各分支的支持率^[26]。

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