[摘要]該研究從形態(tài)學及分子生物學角度研究新疆維吾爾醫(yī)常用藥材沙棗的基原是否為胡頹子屬3種沙棗。隨機選擇不同產(chǎn)地3種沙棗的葉片、花、果實，通過形態(tài)學比較外觀差異；使用DNA條形碼ITS2序列對新疆3種17份沙棗ITS2序列進行PCR擴增和測序，比較17份樣品ITS2序列種內(nèi)和種間變異、采用NJ樹法及ML法對其親緣關系進行分析，結(jié)果表明新疆胡頹子屬3種沙棗葉片、花、果實均無明顯區(qū)別特征，肉眼不易區(qū)分；沙棗、尖果沙棗、東方沙棗ITS2序列長度變化范圍為220～223 bp，平均GC質(zhì)量分數(shù)為61.9%，單倍型數(shù)分別為4，3，3，NJ樹及ML樹均不能將三者區(qū)分。因此，從分子生物學角度看，新疆胡頹子屬3種沙棗可能為同一起源，均可作為維吾爾藥材沙棗的基原植物，但需進一步結(jié)合其分布、化學成分和藥理藥效等因素進行綜合深入的研究。
　　[關鍵詞]DNA條形碼；ITS2；沙棗；鑒定；基原植物
　　沙棗是胡頹子科Elaeagnaceae胡頹子屬Elaeagnus植物，主要分布在我國新疆和內(nèi)蒙古西部，其樹皮、枝葉、花、果等皆為維吾爾醫(yī)常用藥材，果實可治療頭痛、熱性咳嗽、腹瀉等^[1]；樹皮具有清熱涼血、收斂止痛的功效^[2]；花可治療慢性支氣管炎^[3]�，F(xiàn)代藥理學研究證明，藥材沙棗具有促進傷口愈合^[4]、抗菌殺蟲^[5]、鎮(zhèn)痛^[6-7]和松弛肌肉^[8]等功效。除此之外，沙棗樹還具有抗風沙、耐鹽漬、耐干旱的特質(zhì)，是防風固沙、開荒造田的首選林木，是集多種功能為一體的經(jīng)濟型樹種。我國分布的胡頹子屬沙棗的種類不多，但存在爭議，《中國植物志》和《新疆植物志》中收載了沙棗E. angustifolia、尖果沙棗E. oxycarpa及東方沙棗E. angustifolia var. orientalis（變種）^[9-10]，《中國沙漠植物志》還收錄了大果沙棗E. moorcroftii^[11]。沙棗采用經(jīng)典植物分類鑒定方法定種困難，需要同時依據(jù)花期及果期特征，常常同份標本鑒定出不同結(jié)果。黃俊華等^[12]采用定株標記采集、花果同時比較的方法，結(jié)合多份標本，根據(jù)葉、花和果實特征，將新疆沙棗分為3種1變種；于瑋瑋等^[13]對大果沙棗和尖果沙棗的染色體核型進行分析，結(jié)果顯示，雖然兩者染色體結(jié)構(gòu)存在細微差別，但起源和演化中存在一定的親緣關系�！吨腥A人民共和國藥品標準（維藥分冊）》藥材“沙棗”僅收載了沙棗E. angustifolia^[14]，而新疆傳統(tǒng)習慣以沙棗、尖果沙棗及東方沙棗藥用為主，大果沙棗食用為主[1，15]。因此，研究和明確維吾爾藥材沙棗的基原植物，對實現(xiàn)其標準化、現(xiàn)代化具有重要的意義。
　　目前維吾爾藥材沙棗的相關研究多集中在形態(tài)和化學成分比較等方面，相關種源鑒定鮮見報道。DNA條形碼研究已成為近年來生物分類學研究的熱點和前沿，它是一種利用基因組中一段通用的標準短序列來進行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)^[16]，通過建立生物DNA條形碼系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準確和自動化的物種鑒定。陳士林研究團隊證明：ITS2序列可以作為標準DNA條形碼鑒別藥用植物及其近緣物種^[17-20]，并以ITS2序列為基礎初步建立了藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡查詢系統(tǒng)。2011年，中國植物條形碼工作組（Chinese Plant BOL Group）建議將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心DNA條形碼^[21]。本研究采用此方法研究新疆胡頹子屬植物，旨在明確維吾爾藥材沙棗的植物基原，為維吾爾藥材的標準化提供科學的依據(jù)與方法。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　3種沙棗樣品包括葉片、花、果實采自新疆各地，DNA條形碼實驗材料按照標準規(guī)則采集，由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，同時以胡頹子科植物沙棘作為外類群進行研究。憑證標本保存于新疆中藥民族藥研究所標本館（新疆XTNM），實驗所獲得的序列已提交至GenBank，詳見表1。
　　PCR擴增所用引物ITS2序列由生工生物工程合成，其正向序列為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向序列為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生物。
　　實驗所使用的DNA提取研磨儀為GRINDER，型號GT-100；離心機為上海安亭科學儀器，型號Anker TGL-16C；PCR擴增儀為An Analytik Jena company，型號070-851。
　　1.2 方法
　　1.2.1 3種沙棗外觀形態(tài)比較 隨機選擇不同產(chǎn)地3種沙棗的葉片、花、果實，測定葉片長寬、果實大小及形狀等進行形態(tài)學比較。
　　1.2.2 DNA的提取及檢測 稱取干燥葉片30 mg、果實25 mg，使用DNA提取研磨儀1 000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小及質(zhì)量。
　　1.2.3 PCR擴增及測序^[22] 反應體積25 μL，包括dNTP 0.4 μL（10 mmol·L-1），PCR緩沖液2.5 μL（10×），引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1），聚合酶1.0 U，總DNA 1 μL（約30 ng）；擴增程序：94 ℃，變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40個循環(huán)）；72 ℃延伸10 min；擴增結(jié)果由美吉生物測序公司雙向測序。
　　1.2.4 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖用CodonCode Aligner V 4.0.4（CodonCode Co.，USA）校對拼接，去除引物區(qū)。將所有序列由軟件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比對^[23]，ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列^[24]，基于K2P模型分析種內(nèi)變異和種間變異[16，25]。用鄰接（NJ）法及最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，使用bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支的支持率^[26]。

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