實驗室菌株管理制度

　1. 目的

　建立實驗室菌株管理制度。

　2. 范圍

　適用于實驗室菌株的管理。

　3. 職責

　3.1.實驗員和實驗室管理員負責對本制度實施。

　3.2.QA 負責監(jiān)測本規(guī)程的執(zhí)行。

　4. 規(guī)程

　4.1. 菌種管理

　4.1.1.涉及菌種 ① 大腸埃希菌 Escherichia coli ② 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ③ 銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa ④ 乙型副傷寒沙門菌 Salmonella apecies ⑤ 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis ⑥ 生孢梭菌 Clostridium sporogenes ⑦ 白色念珠菌 Candida albicans ⑧ 黑曲霉 Aspergillus niger 4.1.2.菌種采購 根據(jù)計劃及定期檢查的結果，按時從省級藥檢所、衛(wèi)生防疫站等部門采購來自中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學菌種保藏中心（China Medical Culture Collection，CMCC）等國際法定菌種保藏機構的標準菌株。菌種到達實驗室后，接受菌種時應仔細檢查菌種的名稱、數(shù)量、完整性等，并做好記錄工作，如名稱、菌號、數(shù)量、來源、接種日期、代數(shù)等（見附件一：菌種采購登記表）。

　4.1.3.菌種復活 4.1.3.1.凍干菌種

　若購入的標準菌株是玻璃安瓿瓶裝的凍干粉劑則需對凍干菌種進行復活。首先清潔安瓿，安瓿的表面用 75%的酒精擦拭并讓其自然干燥；然后用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）；再用一無菌吸管移取 1-2ml適宜的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基到安瓿中；輕輕地旋轉安瓿使凍干菌種和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解；最后將安瓿內菌液轉接到相應的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中在適宜的條件下培養(yǎng)，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌于 30-35℃培養(yǎng) 18-24 小時，白色念珠菌于 20-25℃培養(yǎng) 24-48 小時，黑曲霉于 20-25℃培養(yǎng) 5-7 天。

　4.1.3.2.斜面菌種

　若購入的標準菌株是試管裝瓊脂斜面則不需要進行菌種復活。

　4.1.4.菌種確認 取上述凍干菌種（細菌）的液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物或斜面菌種（細菌）的斜面培養(yǎng)物劃線接種到胰酪大豆胨瓊脂平皿上，30-35℃培養(yǎng) 48 小時，培養(yǎng)結束后觀察菌落形態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進行革蘭氏染色和鏡檢，觀察其染色特性及菌形。

　取上述凍干菌種（真菌）的液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物或斜面菌種（真菌）的斜面培養(yǎng)物劃線接種到沙氏葡萄糖瓊脂平皿上，20-25℃培養(yǎng) 5-7 天，觀察菌落形態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進行染色和鏡檢，觀察其染色特性及菌形。

　4.1.4.1.菌落形態(tài)

　A. 大腸埃希菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，乳白色，光滑，薄，蔓延，半透明。

　B. 金黃色葡萄球菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，白色至淺黃色，光滑，濕潤，全緣。

　C. 銅綠假單胞菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，白色，伸展形，邊緣透明，不規(guī)則，培養(yǎng)基變?yōu)闇\綠色至暗黑色。

　D. 沙門菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，淺灰色，濕潤，光滑，半透明。

　E. 枯草芽孢桿菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，奶油色至微褐色，粗糙，不透明，不閃光，蠟質，蔓延。

　F. 生孢梭菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，中部突起，白色至淡黃色，邊緣模糊不規(guī)則，表面無光澤。

　G. 白色念珠菌：沙氏葡萄糖瓊脂平皿或斜面上，乳白色，濕潤，光滑，易挑取，正、反面及邊緣、中心顏色一致，質地均勻。

　H. 黑曲霉：沙氏葡萄糖瓊脂平皿或斜面上，起初白色，常常出現(xiàn)鮮黃色區(qū)域，后黑色，反面無色或中央部分略帶黃褐色。

　4.1.4.2.鏡檢

　A. 大腸埃希菌：革蘭氏陰性桿菌或短桿菌，無芽孢。

　B. 金黃色葡萄球菌：革蘭氏陽性球菌，排列不規(guī)則，堆聚似葡萄串狀。

　C. 銅綠假單胞菌：革蘭氏陰性桿菌，長短不一，無芽孢。

　D. 沙門菌：革蘭氏陰性桿菌，無芽孢。

　E. 枯草芽孢桿菌：陽性桿菌，部分內含芽孢，橢圓形，中生或次端生。

　F. 生孢梭菌：革蘭氏染色陽性，芽孢卵圓形、次端生。

　G. 白色念珠菌：卵圓形，出芽繁殖，革蘭氏陽性。

　H. 黑曲霉：菌絲為有隔的多細胞，分生孢子梗頂端膨大成頂囊，頂囊的表面以輻射狀長出二層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串圓形的分生孢子。

　4.1.5.菌種傳代與保藏 4.1.5.1.將微生物接種至一新的培養(yǎng)基上/內，每萌發(fā)一次即稱為一代，菌種的傳代次數(shù)（自原始凍干菌種起）不得超過 5 代。

　4.1.5.2.本實驗室菌種保藏采用斜面低溫保藏法。將菌種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉移到 2-8℃冰箱中保藏。視菌種的生長情況，正常情況下芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌）每 3 個月傳代接種一次，其他細菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、生孢梭菌）每月傳代接種一次，酵母菌（白色念珠菌）每 4 個月傳代接種一次，絲狀真菌（黑曲霉）每 4 個月傳代接種一次。每次傳代接種 2 支或 2 支以上試管，一支作為下一次傳代使用，其他的作為日常檢驗中使用。

　4.1.5.3.菌種傳代操作步驟

　細菌和酵母菌：右手執(zhí)接種工具，左手執(zhí)試管，燒針滅菌，拔塞燒口，挑菌移植，燒口塞管，燒針滅菌，培養(yǎng)。

　霉菌：將 2-3ml 0.9%無菌氯化鈉溶液加入到原菌種管內，反復震搖，將孢子洗脫，取適量孢子懸液接種于瓊脂斜面上，燒口塞管，培養(yǎng)。

　4.1.5.4.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

　大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌使用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30-35℃培養(yǎng) 24 小時(枯草芽孢桿菌培養(yǎng) 48 小時)，白色念珠菌和黑曲霉使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20-25℃培養(yǎng) 5-7 天。

　4.1.5.5.質量控制

　每次傳代接種以后觀察菌落形態(tài)和染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長，則應作進一步調查，所有被確認受到污染的菌種應及時銷毀，不得用于實驗中。將符合規(guī)定的菌種進行編號、貼上標簽(見附件二、菌株保存標簽)，標簽中應表明名稱、菌號、編號、有效期、接種人等。菌種的編號按接種日期、代數(shù)和數(shù)量編寫。如 2018 年 1 月 1 日傳代接種大腸埃希菌 2 支，用來傳代的大腸埃希菌是第 3 代，那傳代以后的菌種編號為 20180101-3-1，20180101-3-2，前面的 20180101 是接種日期，中間的 3 表示代數(shù)，最后的 1 和 2 表示數(shù)量。菌種傳代的整個過程都必須做好詳細的菌種傳代記錄（見附件三：菌種傳代、確認、處理記錄）。

　4.1.6. 菌種儲存

　菌種需單獨放置于 2-8℃冰箱內保藏，有專人負責保管并建立實驗室現(xiàn)有菌種清單（見附件四：實驗室現(xiàn)有菌種清單）。

　4.2. 菌種的使用

　4.2.1.菌種必須在有效期內才能使用，每次使用應做好相應的記錄工作（具體見附錄五：菌種使用記錄）

　4.2.2.菌懸液的制備 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌和枯草芽孢桿菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，30-35℃培養(yǎng) 18-24 小時；白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20-25℃培養(yǎng) 24-48 小時；黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，20-25℃培養(yǎng) 5-7 天。用 0.9%無菌氯化鈉溶液（稀釋黑曲霉孢子時加入 0.05%聚山梨醇酯-80）制成實驗中規(guī)定濃度的菌懸液或孢子懸液。稀釋后菌懸液于 2-8℃條件下保存，制備后的 24 小時內使用。

　4.3. 菌種的銷毀

　使用后的菌種，必須經(jīng)過 121℃、30 分鐘高溫高壓濕熱滅菌處理，方可遺棄，同時做好銷毀記錄。

　4.4. 其他相關事項

　菌種是特殊的標準品，在一定條件下，許多都是病原菌，如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌等。所以必須實行嚴密安全的保藏管理，用于菌種保藏的冰箱需上鎖；有關菌種的所有操作都應在生物安全柜中進行，僅有微生物實驗員才能使用菌種；操作人員必須穿工作服，配戴手套，口罩等防護用品；在操作過程中，要求無菌操作，防止交叉污染或將污染傳播到別的地方。

　5. 記錄

　菌種采購登記表 菌種保存標簽 菌種傳代、確認、處理記錄 實驗室現(xiàn)有菌種清單 菌種使用記錄 生物指示劑購買和領用記錄 6. 相關文件

　實驗室管理規(guī)程

　HYT/SMP-QA-ZB-004 偏差調查與處理管理規(guī)程

　HYT/SMP-QA-ZB-008 檢驗異常管理規(guī)程

　HYT/SMP-QA-ZB-010 7. 參考文獻

　無菌醫(yī)療器具生產(chǎn)管理規(guī)范

　YY0033-2000

　中國藥典 2020 版

　8. 修訂歷史

　序號 生效日期 文件編號及版本號 修訂性質及原因 修訂內容及具體條款

　附件 1：

　菌種采購清單

　編號：

　HYT/SMP-QA-ZB-028 日 期 名 稱 菌 號 代數(shù) 批號 來 源 數(shù) 量 經(jīng)辦人 復核人

　附件 2：

　 菌種保存標簽

　 HYT/SMP-QA-ZB-028 菌種名稱

　標 準 號

　菌種編號

　接種日期

　傳 代 數(shù)

　有 效 期

　傳 代 人

　 附件 3：

　菌種傳代、確認、處理記錄 編號：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌種名稱 菌

　號 來

　源 代

　數(shù)

　 菌種傳代接種情況：

　菌種

　確認 菌落形態(tài)：

　 鏡檢：

　 API 鑒定：

　確認結果

　□符合規(guī)定

　□不符合規(guī)定 操作人：

　復核人：

　菌種編號

　保藏條件

　有效期

　處理情況 菌種編號 滅菌溫度 滅菌時間 操作人 日期

　 附件 4：

　實驗室現(xiàn)有菌種清單 編號：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌種名稱

　狀

　態(tài)

　菌

　號

　大腸埃希菌 Escherichia coli

　 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus

　 銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa

　 沙門菌 Salmonella apecies

　 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis

　 生孢梭菌 Clostridium sporogenes

　 白色念珠菌 Candida albicans

　 黑曲霉 Aspergillus niger

　“○”表示無，“●”表示有

　 QC/日期：

　部門經(jīng)理/日期：

　 附件 5：

　菌種使用記錄 編號：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌種名稱及菌號

　菌種編號

　有效期

　日

　期 編

　號 使用人 日

　期 編

　號 使用人

　 附件 6：

　 生物指示劑購買和領用記錄

　編號：

　HYT/SMP-QA-ZB-028

　指示劑名稱：

　購買日期：

　批號：

　數(shù)量：

　保存條件：

　有效期：

　備注：

　日期 數(shù)量 結余 領用人 發(fā)放人 日期 數(shù)量 結余 領用人 發(fā)放人

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