摘要:本文建立了一種簡(jiǎn)便、快速的提純方法,從豬心肌中分離純化得到肌球蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過超速離心和硫酸銨分級(jí)鹽析,主要雜蛋白被除去。所得蛋白經(jīng)SDS-PAGE、HPLC和XRD圖譜分析,說明提純的肌球蛋白達(dá)電泳純,并有結(jié)晶特征。測(cè)定其比活力為0.293U/mg,活力得率42.1%,純化倍數(shù)4.9。本法具有成本低,純度高,酶活良好的特點(diǎn),結(jié)果滿意。
　　關(guān)鍵詞:心肌肌球蛋白;分離純化;硫酸銨鹽析
　　中圖分類號(hào):Q512.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
　　
　　心肌肌球蛋白(cardiac myosin,CM)分子量約520KDa,由兩條重鏈(MHC,220 KDa)和兩對(duì)輕鏈(MLC1,27KDa;MLC2,20KDa)組成[1]。CM具有ATP酶活性,是心肌的主要結(jié)構(gòu)和收縮蛋白。心肌收縮能力受多種因素的影響,興奮收縮耦聯(lián)的各個(gè)環(huán)節(jié)都能影響收縮力,其中肌球蛋白ATP酶活性是控制收縮能力的主要因素。
　　研究表明,CM結(jié)構(gòu)或功能的改變與心室功能障礙、心力衰竭和心律失常等心肌病變有直接關(guān)系[2,3]。因此,從心肌組織中有效分離純化CM,是在分子水平上,深入研究心肌病變的發(fā)病機(jī)理和預(yù)防措施的重要前提。目前提取純化CM都是利用肌球蛋白在高離子強(qiáng)度下可溶,而在低離子強(qiáng)度下不溶的性質(zhì)進(jìn)行的,但大多操作繁瑣,成本高,蛋白收率低或ATP酶活損失大[4-11],因此,尋找更佳的CM提純方法具有重要意義。
　　本文對(duì)提純方法進(jìn)行了部分改進(jìn),從豬心肌提取了CM,建立了CM的純化方案。此方案僅需簡(jiǎn)單的超速離心、硫酸銨分級(jí)鹽析操作,即可達(dá)到純化要求,且所用材料均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)用材,費(fèi)用低廉,可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室操作及臨床研究。
　　
　　1 實(shí)驗(yàn)部分?
　　
　　1.1 儀器、材料與試劑?
　　1.1.1 主要儀器
　　CP100MX超速冷凍離心機(jī)(HITACHI, 日本),Centrifuge5417R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(eppendorf, 德國),Ultra Freeze 5410超低溫冰箱(HETO公司,捷克),CR22G高速冷凍離心機(jī)(HITACHI, 日本),DY-Ⅲ垂直平板電泳成套設(shè)備(北京六一儀器廠),GeneGenius & GeneGnome凝膠成像系統(tǒng)(SYNOPTICS LTD, 英國),MAXI-DRY LYO真空濃縮(凍干)系統(tǒng)(HETO公司,捷克),L-7000高效液相色譜儀(L-7455 DAD 檢測(cè)器,L-7300柱溫箱,L-7100四元梯度泵,D-7000 HPLC 系統(tǒng)工作站軟件包。HITACHI,日本),C18柱(江蘇漢幫科技有限公司),D8-Advance Powder X-射線粉末衍射儀(Bruker公司,德國),HH-4 恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠), FK-A 組織搗碎機(jī)(江蘇金壇佳美儀器公司), pHS-25酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠),磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠)。?
　　1.1.2 材料與試劑
　　新鮮豬心(冰生理鹽水洗凈后-70℃冰箱保存);低分子量Marker蛋白(上�；�康生物技術(shù)有限公司);牛血清白蛋白(BSA, 分子量68 000, 電泳純, Sigma公司); Na2ATP(AR Sigma公司);β-巰基乙醇(AR Amresco 公司);SDS(AR Sigma公司);丙烯酰胺(AR 廣州維佳科技公司, 日本分裝);N", N"-甲叉二甲基雙丙烯酰胺(AR 瑞士進(jìn)口分裝);硫酸銨(AR Sigma公司);N,N,N",N"-四甲基乙二胺(TEMED, AR 上海潤(rùn)潔有限公司, 生化試劑);考馬斯亮藍(lán)R-250、G-250(AR Amresco 公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris, AR Sigma公司);其它試劑均為國產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。?
　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法?
　　1.2.1 CM的提取及純化
　　4℃下操作。pH7.4的Tris-HCl緩沖液中均含有0.001 mol•L-1EDTA,0.01 mol•L-1NaPPi,0.002 mol•L-1β-巰基乙醇和0.005 mol•L-1MgCl2。?
　　1.2.1.1 CM粗提液的制備
　　取豬心左心室適量,剪成小塊后加入400 mL 0.05 mol•L-1磷酸緩沖液(pH=6.8)勻漿,3600 rpm離心10 min,反復(fù)4次,棄上清。沉淀溶于適量0.01 mol•L-1 Tris-HCl緩沖液(含0.5 mol•L-1KCl),離心,上清即為CM粗提液。?
　　1.2.1.2 低鹽析出,濃鹽溶解
　　上清中加入9倍體積超純水,調(diào)節(jié)溶液pH至5.4,緩慢攪拌3 h后10000 rpm離心10 min。用適量0.05 mol. L-1Tris-HCl(含1.0 mol•L-1 KCl)溶解沉淀,并用0.01 mol. L-1 Tris-HCl(含0.5 mol•L-1 KCl)透析過夜。?
　　1.2.1.3 超速離心
　　于透析后的溶液中加入等體積超純水及Na2ATP,使Na2ATP的濃度為0.002 mol.L-1。靜置2 h后30000 rpm離心60 min,收集上清。?
　　1.2.1.4 硫酸銨分級(jí)鹽析
　　在上清液中加入研細(xì)的(NH4)2SO4達(dá)到36%飽和度,用(NH4)2SO4飽和度為36%的0.05 mol•L-1 Tris溶液調(diào)節(jié)pH在6.8~7.0之間,靜置2 h后12000 rpm 離心。再向上清液加入(NH4)2SO4使飽和度達(dá)41%,用(NH4)2SO4飽和度為41%的0.05 mol•L-1 Tris溶液調(diào)節(jié)pH在6.8~7.0之間,靜置2 h后離心。沉淀物用少量0.01 mol•L-1Tris-HCl(含0.6 mol•L-1KCl,不含MgCl2)重溶、透析24 h,更換透析外液4~5次。所得濃縮的CM溶液分裝或冷凍干燥后,冷凍儲(chǔ)存。?
　　1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定
　　采用Bradford法[12],以BSA為基準(zhǔn)物質(zhì),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。?
　　1.2.3 CM的ATP酶活力測(cè)定
　　參照文獻(xiàn)[13]的方法,建立酶反應(yīng)體系,置37℃水浴中孵育反應(yīng)10 min。離心后取上清25 μL測(cè)定A660。根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線確定無機(jī)磷含量。規(guī)定肌球蛋白ATP酶活性單位(U)為單位時(shí)間(1 min)內(nèi)單位質(zhì)量(1.0 mg)的肌球蛋白催化ATP分解所釋放的無機(jī)磷的微摩爾數(shù),即1U=1 μmol•mg-1•min-1,此酶活單位即為單位比活力。?
　　1.2.4 CM的純度鑒定
　　將樣品蛋白用0.01 mol•L-1 Tris-HCl緩沖液(pH7.5, 0.6 mol•L-1 KCl, 0.01 mol•L-1 NaPPi, 0.001 mol•L-1 EDTA, 0.002 mol•L-1β-巰基乙醇, 0.005 mol•L-1 MgCl2)稀釋到1.0 mg•mL -1,取適量與2倍上樣緩沖液等體積混合同Marker蛋白一起加熱煮沸5 min。冷卻至室溫后離心(6000 rpm,5 min),取上清液上樣10 μL,Marker蛋白上樣20 μL。采用PAGE不連續(xù)垂直板不連續(xù)電泳法[14],濃縮膠濃度4%,分離膠濃度10%,凝膠厚度約0.75 mm,調(diào)節(jié)電壓80 V開始電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至濃縮膠和分離膠界面時(shí)將電壓升至120 V,穩(wěn)流電泳2 h。膠片用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,置搖床經(jīng)甲醇-冰乙酸-水(25?8?67,V/V)溶液脫色至透明后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并攝像。?
　　1.2.5 HPLC條件
　　流速1.000 mL•min-1,TC = 30℃,樣品濃度 1.6 mg•mL-1,進(jìn)樣量 10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)λ = 254 nm,C18柱(250×4.6 mm)。流動(dòng)相A:6%乙腈,流動(dòng)相B:0.20 mol•L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0),流動(dòng)相A?流動(dòng)相B(V/V) = 60%?40%。?
　　1.2.6 X-射線粉末衍射條件
　　X-射線源Cu Kα 線,電壓40 kV,電流40 mA,掃描角度20～120°(2θ),掃描速度1°•min-1。
　　
　　2 結(jié)果與討論?
　　
　　2.1 豬心肌CM的分離純化
　　表1為豬心肌CM分離純化過程中蛋白收率和酶活力變化情況。對(duì)CM粗提液和硫酸銨鹽析純化后的總蛋白、總活力、比活力進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算活力得率,純化倍數(shù),統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。
　　
　　在低鹽析出、濃鹽溶解過程中,本文對(duì)文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn),在降低離子強(qiáng)度的同時(shí),調(diào)節(jié)溶液pH至CM的等電點(diǎn),使沉淀更加完全。由表1可知,肌球蛋白逐步被純化,經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析后,CM收率為4.5 mg•g-1濕組織。該結(jié)果是親和層析純化法的23倍[10],與Shiverick [8] 的結(jié)果相近,而文獻(xiàn)方法溶液用量大,需多次超速離心,操作繁瑣。
　　表2說明,CM粗提液的比活力為0.064U•mg-1,純化后的比活力為0.293 U•mg-1,純化倍數(shù)4.9, 活力得率42.1%。文獻(xiàn)[15]采用DE 52層析法的純化倍數(shù)為2.9,活力得率7.8%,效果不如本法。
　　
　　2.2 CM純度鑒定
　　CM提純過程中的SDS-PAGE圖譜(圖1)說明,超速離心(圖1(3))和分級(jí)鹽析(圖1(4)、(5))步驟去除了分子質(zhì)量約43KDa的肌動(dòng)蛋白(actin)和其它雜蛋白,但也有部分CM損失。純化的CM(圖1(5))顯示了典型的肌球蛋白電泳帶,最上面一條為重鏈,下面兩條為兩對(duì)輕鏈,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。重鏈下方的一些細(xì)小條帶,可能是提純過程中CM自身降解所致[16,17]。因此,在緩沖液中加入焦磷酸鈉、EDTA、ATP、Mg2+等,并盡量縮短時(shí)間、低溫操作,可起到降低CM聚合、保持其酶活性的作用[18]。
　　
　　M-Marker蛋白; 1-粗提的肌球蛋白; 2-濃鹽溶解所得蛋白;3-超速離心所得蛋白;4-棄去的36%飽和度(NH4)2SO4沉淀;5-終產(chǎn)物即41%飽和度(NH4)2SO4沉淀?
　　2.3 HPLC分析
　　圖2顯示了相同條件下,CM的粗提液和純化后的HPLC圖。
　　色譜條件:流速1.000 mL•min-1,TC = 30℃,λ = 254 nm,進(jìn)樣量 10 μL(1.6 mg•mL-1),C18柱(250×4.6 mm),流動(dòng)相A:6%乙腈,流動(dòng)相B:0.20 mol•L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0),流動(dòng)相A?流動(dòng)相B(V/V)= 60%?40%
　　
　　由圖2可知,保留時(shí)間2.21 min的組分為純化的CM,通過超速離心和硫酸銨鹽析等步驟,除去了保留時(shí)間2.05 min的主要雜蛋白。?
　　2.4 X-射線衍射(XRD)圖譜
　　圖3為CM的XRD圖譜。圖中顯示了確定的銳衍射峰,其中2θ 在28.4°和40.6°出現(xiàn)兩個(gè)強(qiáng)的衍射峰,在45~80°出現(xiàn)三個(gè)較弱的衍射峰,說明CM具有一定結(jié)晶性的特征[19]。
　　
　　
　　3 結(jié)論
　　
　　對(duì)傳統(tǒng)方法稍加改進(jìn),從豬心肌中提取CM,并用36-41%飽和度硫酸銨進(jìn)行純化。利用SDS-PAGE、HPLC和XRD對(duì)CM的純化程度進(jìn)行了表達(dá)和分析。提純后CM的 HPLC圖顯示單一峰,電泳譜帶與文獻(xiàn)報(bào)道一致,說明硫酸銨鹽析有效除去了肌動(dòng)蛋白和其它雜蛋白,純化的CM基本達(dá)電泳純。CM的XRD圖譜有兩個(gè)強(qiáng)的衍射峰,說明其有結(jié)晶性特征。提純的蛋白得率為4.5 mg•g-1濕組織,比活力0.293 U•mg-1,純化倍數(shù)4.9,活力得率42.1%。與文獻(xiàn)相比,本法操作簡(jiǎn)單、成本低廉,得率高并保持了較高的酶活性,具有較高的實(shí)用價(jià)值。
　　
　　參考文獻(xiàn)?
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