摘要：本文以近年來(lái)藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合研究為基礎(chǔ)，對(duì)二者作用的研究方法作了回顧與總結(jié)，并簡(jiǎn)要對(duì)各種方法作一評(píng)論。 　　關(guān)鍵詞：藥物；蛋白質(zhì)；研究方法 　　中圖分類號(hào)：R977.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　
　　1 前言
　　
　　蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)占特殊地位，它們是構(gòu)成原生質(zhì)的主要成分，在各種生命過(guò)程中起著重要作用。研究藥物分子與蛋白質(zhì)的作用，對(duì)理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及闡明藥物動(dòng)力學(xué)、耐藥性和毒副作用的機(jī)理有重要意義。
　　目前，這方面的研究主要集中于藥物分子與血清蛋白和血漿蛋白的作用，其中絕大多數(shù)是與人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）的作用。白蛋白是主要的血清蛋白，可以和許多內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合，通過(guò)形成復(fù)合物來(lái)完成血漿的功能。藥物進(jìn)入人體后，只有通過(guò)血漿的貯存和運(yùn)輸，才能達(dá)到病灶部位，發(fā)揮藥效。隨著科學(xué)技術(shù)和方法的引入，這方面的研究?jī)?nèi)容也在不斷深入。
　　
　　2 近代研究方法
　　
　　2.1 光譜方法
　　蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基都具有特殊的光學(xué)活性。許多藥物分子本身也具有光學(xué)活性，或與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后產(chǎn)生光學(xué)活性，因此用光譜方法通過(guò)蛋白質(zhì)分子結(jié)合藥物分子后結(jié)構(gòu)的變化研究結(jié)合機(jī)理，是有效和廣泛的方法。
　　藥物與生物分子相互作用的研究，熒光光譜法是應(yīng)用廣泛的重要手段，它具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。它能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，這些參數(shù)從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過(guò)對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定，不但可以定量分析，還可以推斷蛋白質(zhì)分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化。蛋白質(zhì)分子的內(nèi)源熒光主要是由色氨酸發(fā)出的，根據(jù)Forster能量轉(zhuǎn)移機(jī)理可求出結(jié)合蛋白質(zhì)的藥物分子距蛋白質(zhì)分子中色氨酸的距離，由此推測(cè)藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的空間部位；可直接根據(jù)藥物對(duì)其內(nèi)源熒光的猝滅或增強(qiáng)程度來(lái)考察相互作用的機(jī)理和結(jié)合強(qiáng)度，根據(jù)相應(yīng)公式求得結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；用藥物分子與結(jié)合部位已知的探針來(lái)代替（即標(biāo)記配體）競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)結(jié)合部位，可確定藥物分子對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。所以，該方法在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。近年來(lái)，在熒光猝滅法的基礎(chǔ)上，同步熒光法和三維熒光光譜法等新技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。
　　紫外―可見(jiàn)光譜法也是研究藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理最常用、最方便的方法。因?yàn)橛行�藥物與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，它們的吸收光譜會(huì)有一定的改變，出現(xiàn)吸收峰位移或譜峰寬度變化，由此可研究蛋白分子與藥物間的結(jié)合強(qiáng)弱及結(jié)合機(jī)理。同時(shí)，共振拉曼光譜、紅外光譜等光譜方法也應(yīng)用于藥物與生物大分子相互作用的研究。
　　在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，幾種光譜方法常結(jié)合使用。如Kamat利用圓二色譜、熒光光譜和紫外光譜法相結(jié)合的方法研究了氟喹諾酮藥物對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)制，用熒光猝滅法測(cè)得結(jié)合常數(shù)n與表觀結(jié)合常數(shù)K，還根據(jù)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論求得BSA與氟喹諾酮藥物之間的結(jié)合距離。BSA-氟喹諾酮藥物二元體系的同步熒光光譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜和圓二色譜表明牛血清白蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化。Tang等分別用共振光生物傳感器、熒光光譜和分子對(duì)接模擬技術(shù)研究了柔紅霉素與HSA的結(jié)合行為。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柔紅霉素使HSA的內(nèi)源熒光猝滅是靜態(tài)過(guò)程，而且二者的結(jié)合受體系pH的影響。對(duì)接模型顯示，結(jié)合位點(diǎn)都不處于HSA的經(jīng)典結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步分析表明，疏水作用、氫鍵和靜電作用是二者結(jié)合的主要推動(dòng)力。
　　
　　2.2 量熱法
　　生物體新陳代謝的實(shí)質(zhì)就是在有機(jī)體內(nèi)的一系列化學(xué)反應(yīng)，在這些過(guò)程中，有一部分能量不可避免會(huì)以熱效應(yīng)的形式表現(xiàn)，利用微量熱手段對(duì)這些熱效應(yīng)做精密的測(cè)量與詳細(xì)的討論，就構(gòu)成了生物化學(xué)熱力學(xué)的研究?jī)?nèi)涵。此外，量熱法對(duì)被研究體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)以及電化學(xué)性質(zhì)等沒(méi)有任何條件的限制，因而有獨(dú)到之處。常用的微量熱法有常規(guī)量熱法和差示掃描量熱技術(shù)（Differential Scanning Calorimetry， DSC）等，已經(jīng)用于藥物分子與蛋白質(zhì)的相互研究中。
　　量熱學(xué)可根據(jù)不同的結(jié)合模型，如位點(diǎn)結(jié)合模型、鄰近排斥方程等，確定蛋白質(zhì)與小分子相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合數(shù)。對(duì)于不同小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，它們的各種熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合數(shù)不同，這種差異在分子識(shí)別上是很有用的，可以根據(jù)結(jié)合數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)來(lái)判斷蛋白質(zhì)與小分子的作用機(jī)理。
　　分子識(shí)別過(guò)程是一個(gè)很重要的生命過(guò)程。目前，國(guó)內(nèi)外許多科學(xué)家正在致力于探索分子識(shí)別過(guò)程中的非共價(jià)鍵作用力，以便確定結(jié)合的特定性和效率。利用X-射線或NMR只能確定它們識(shí)別過(guò)程中的三維結(jié)構(gòu)，不能得到識(shí)別過(guò)程中的能量變化。許多蛋白質(zhì)-配體之間的相互作用表現(xiàn)在熵和熱容方面有很大的變化，可以通過(guò)DSC來(lái)研究蛋白質(zhì)-配體之間的相互作用量熱學(xué)參數(shù)。利用DSC測(cè)定蛋白質(zhì)-配體之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，可以通過(guò)建立模型，測(cè)定蛋白質(zhì)變性前后配體的各種參數(shù)，從而計(jì)算得到蛋白質(zhì)-配體之間相互作用的焓變和熵變及熱容。Barone等人建立了一個(gè)熱力學(xué)模型，利用DSC變性前后的溫度變化，進(jìn)一步通過(guò)各種數(shù)學(xué)變換，得到蛋白質(zhì)與配體相互作用的焓變與熱容。他們研究了2"CMP和3"CMP與RNAA酶相互作用的量熱曲線，根據(jù)熱力學(xué)模型，通過(guò)量熱曲線得到它們相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，并根據(jù)這些參數(shù)討論其識(shí)別過(guò)程的機(jī)理和電解質(zhì)對(duì)這些熱力學(xué)性質(zhì)的影響。他們還進(jìn)一步利用DSC研究了S-多肽和S-蛋白質(zhì)、葡萄糖與酵母己糖激酶相互作用的量熱曲線，利用他們所建立的模型進(jìn)行分析，得到了一些有用的參數(shù)，為蛋白質(zhì)間相互作用的機(jī)理研究提供了一種新的方法。有人利用DSC研究了人血清蛋白與脂肪酸相互作用的量熱曲線，根據(jù)量熱曲線計(jì)算得到了熱力學(xué)參數(shù)，并根據(jù)這些熱力學(xué)參數(shù)對(duì)它們的結(jié)合機(jī)理進(jìn)行了探討。
　　
　　2.3 核磁共振（NMR）技術(shù)
　　NMR是兩種能夠測(cè)定生物大分子三維空間結(jié)構(gòu)的技術(shù)之一，是研究生物大分子的溶液結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)及分子相互作用的重要工具。特別是在蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)方面，NMR技術(shù)具有其他技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)越性，可以在接近生物大分子的生理環(huán)境（溫度、鹽濃度、pH值等）下對(duì)其溶液進(jìn)行研究，因而得到的結(jié)果更具有說(shuō)服力。近年來(lái)，隨著NMR技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)其研究的生物大分子分子量的限制也從10 KDa以下提高到25 KDa，同時(shí)，利用這一技術(shù)研究生物大分子動(dòng)力學(xué)的方法也有了較大突破。
　　NMR測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法包括四大基本要素：結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要NMR參數(shù)NOE（nuclear overhauser effect）距離測(cè)定；核磁譜峰序列專一性歸屬；NMR結(jié)構(gòu)計(jì)算及結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)；數(shù)據(jù)收集的多維NMR技術(shù)。
　　
　　2.4 其它方法
　　電化學(xué)方法雖然在一定程度上受到電活性與否的限制，但對(duì)于吸收光譜比較弱、電子躍遷譜帶與大分子吸收重疊的組分，無(wú)法用吸收光譜法研究的分子，卻能用直接伏安法進(jìn)行研究。此外，平衡滲析、粘度測(cè)定以及離心超過(guò)濾、高效液相色譜、微滲析、質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳等方法也應(yīng)用于藥物與蛋白質(zhì)分子相互作用的研究。
　　
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