摘要：對(duì)分離純化得到的龍井43多酚氧化酶同工酶在30～50 ℃下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶同工酶PPOⅡ、PPOⅢ在30 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性最高，隨溫度的升高其熱穩(wěn)定性下降；多酚氧化酶粗酶的熱穩(wěn)定在40 ℃時(shí)最高，并整體高于多酚氧化酶同工酶的熱穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果給茶葉生產(chǎn)中維持適當(dāng)?shù)臏囟葋砜刂贫喾友趸傅幕钚蕴峁┝艘罁?jù)。
　　關(guān)鍵詞：茶葉；多酚氧化酶；同工酶；酶活力；熱穩(wěn)定性
　　中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0095-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.024
　　Thermal Stability Analysis on Polyphenol Oxidase Isozymes from Camellia sinensis
　　CHEN Sheng-hu， XU Xiao-yun， WU Meng-yao， HUANG Ying-jie， YAO Yan-ni， HUANG You-yi
　�。∕inistry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Horticulture and Forestry Science College， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
　　Abstract：The thermal stabilities of the polyphenol oxidase isozymes purified from Camellia sinensis cv. Longjing No. 43 were analyzed at 30～50 ℃，the results showed that the activities of two polyphenol oxidase isozymes PPOII and PPOIII were the highest under 30 ℃，and decreased with the increasing of temperature. The thermal stability of crude polyphenol oxidase was the highest under 40 ℃， and the overall thermal stability was higher than those of polyphenol oxidase isozymes. The experiment results provide a basis for maintaining appropriate temperature to control the activity of polyphenol oxidase in tea production.
　　Key words：Camellia sinensis； polyphenol oxidase； isozyme； enzyme activity； thermal stability
　　多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO， EC 1.10.3.1）在茶葉生理代謝及產(chǎn)品加工中具有重要作用。目前對(duì)茶葉PPO粗酶[1-3]研究較多，對(duì)其同工酶[4-6]也有一些報(bào)道，但整體而言對(duì)茶葉PPO同工酶的研究相對(duì)匱乏[7，8]。除在綠茶[9]中需要快速鈍化PPO外，紅茶加工[10，11]以及固定化酶體外制備茶黃素[12-14]等過程中都需要PPO具有很好的催化活性和熱穩(wěn)定性。已證實(shí)茶葉PPO單一同工酶較粗酶有更高的催化效率[5，7]，并且茶葉PPO基因克隆和外源表達(dá)等方面的研究進(jìn)展[15，16]也使得催化活性高、熱穩(wěn)定性佳的單一同工酶的工業(yè)化利用成為可能。本研究在成功分離純化得到PPO同工酶的基礎(chǔ)上，分析了PPO同工酶的熱穩(wěn)定性，豐富了對(duì)茶葉PPO同工酶的研究，可為生產(chǎn)中控制茶葉PPO的活性提供參考。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　龍井43號(hào)（Camellia sinensis var. Longjing 43）一芽二葉鮮葉于2015年春采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)專業(yè)教學(xué)基地。
　　試驗(yàn)儀器：DEAE Sepharose CL-6B（GE Health Bio-Sciences AB公司）； Sephadex G-150（美國(guó)PHARMACIA公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（江蘇金壇中大儀器廠）；Synergy HT酶標(biāo)儀（基因有限公司）。所用試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 PPO同工酶分離純化 按許雷等[7，17，18]PPO同工酶分離純化方法進(jìn)行分離純化。取適量茶鮮葉，加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮，5%，W/V）和0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（料液比1∶2），冰浴研磨，4 ℃下浸提12 h，離心、過濾制得粗酶液。對(duì)粗酶液進(jìn)行30%～80%的硫酸銨沉淀，將所得沉淀用適量0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液溶解后，再用4倍體積同樣的緩沖液脫鹽，制得上樣液。將上樣液用DEAE-Sepharose CL-6B材料進(jìn)行陰離子交換層析，選用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液各2倍柱體積進(jìn)行梯度洗脫，280 nm下檢測(cè)吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。再將收集峰用Sephadex G-150材料進(jìn)行凝膠過濾層析，選用含有0.10 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液等梯度洗脫，280 nm下檢測(cè)吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。重復(fù)上述過程，收集足量樣品，4 ℃保存?zhèn)溆谩?p style="margin-bottom:10px">相關(guān)熱詞搜索：氧化酶 熱穩(wěn)定性 茶葉 同工 多酚