近年來,隨著基因工程學(xué)、分子生物學(xué)和現(xiàn)代分離技術(shù)的快速發(fā)展,蛋白質(zhì)也成了一項質(zhì)量和資源評價的指標(biāo),故探索測定蛋白質(zhì)含量的方法有著重要的意義[1]。目前測定蛋白質(zhì)含量的常用方法有凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Folin酚試劑法和雙辛可寧酸法[2]等。這些方法也分別應(yīng)用于測定不同中藥材中蛋白質(zhì)含量。
　　
　　1 考馬斯亮藍(lán)法
　　
　　考馬斯亮藍(lán)法是 Bradford于1975年建立的一種色素結(jié)合法。其主要原理是考馬斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中與蛋白質(zhì)通過范德瓦爾引力結(jié)合形成最大吸收峰為595 nm的復(fù)合物,其吸光度與蛋白質(zhì)含量在200～1400 μg/ml之間呈線性關(guān)系,故可用于蛋白質(zhì)含量的測定[3]。趙英永[1]等探討了考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定草烏藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量的方法,并建立了快速、靈敏的測定蛋白質(zhì)的方法。
　　由于植物粗提液中含有許多其他物質(zhì),如酚類物質(zhì)、核酸等,而且蛋白質(zhì)的含量比較低,因而諸如Folin酚法,雙縮脲法,紫外吸收法等的應(yīng)用受到了一定的限制,而考馬斯亮藍(lán)法靈敏度高,操作簡便,特異性強(qiáng),快速,且不受酚類物質(zhì)的影響,因而常常在植物組織粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定中被采用[4]。但是,目前還不清楚是否所有的植物蛋白質(zhì)都可以用這種方法測定[5]。
　　
　　2 凱氏定氮法
　　
　　凱氏定氮法 [6]為經(jīng)典的測定蛋白質(zhì)的方法。是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法,是測定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確的方法之一,被國際國內(nèi)較多作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法[7]。周燕等[8]進(jìn)行了八味沉香膠囊中總蛋白質(zhì)的含量測定,結(jié)果可靠,精密度高,重現(xiàn)性好,可作為該品的質(zhì)量控制方法。韓定獻(xiàn)[9]等也采用此法進(jìn)行了天力保膠囊中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量測定,測得蛋白質(zhì)含量為23.00%。利用凱氏定氮法對金銀花枝葉中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測定,結(jié)果顯示,金銀花葉中的蛋白質(zhì)含量與花中含量極為相近[10]。
　　雖然,凱氏定氮法為測定含氮量抽象算蛋白質(zhì)的方法,測定結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好。但此法操作繁瑣,試劑消耗量大,消化時排放的SO2對人體健康造成直接危害,而且費(fèi)時、費(fèi)電、費(fèi)水。
　　
　　3 雙縮脲法
　　
　　雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的原理是,在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,這種紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定各種蛋白質(zhì)含量[11]。汪良駒等[5]探討了用此法測定銀杏葉片可溶性蛋白質(zhì)含量,結(jié)果表明雙脲試劑與銀杏葉片可溶性蛋白質(zhì)反應(yīng)迅速、穩(wěn)定,適合于這種果樹葉片可溶性蛋白質(zhì)測定。應(yīng)用雙縮脲法測定決明子中蛋白質(zhì)含量結(jié)果表明,決明子中蛋白質(zhì)含量較高 [12]。
　　
　　4 Folin酚試劑法
　　
　　Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高(比雙縮脲法靈敏得多),缺點是費(fèi)時間較長[13],要精確控制操作時間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。康東周[14]等認(rèn)為用 Lowry 法測定蛋白質(zhì)含量時,酚類、單糖類等干擾測定,因此需先經(jīng)過蛋白沉淀的處理過程,排除干擾物質(zhì)的影響。吳瑾瑾 [15]等采用Folin酚試劑法測定了康克膠囊中可溶性蛋白質(zhì)的含量,結(jié)果蛋白質(zhì)在25～300 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,r≥0.9990,方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。利用此法測定靈芝產(chǎn)品中多糖肽的含量,結(jié)論是本法穩(wěn)定可靠、簡便快速,可作為靈芝及其產(chǎn)品質(zhì)量控制指標(biāo)[16]。
　　
　　5 紫外分光光度法
　　
　　蛋白質(zhì)分子中,一些氨基酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)在280 nm處有吸收,其光密度值與蛋白質(zhì)含量成正比,可用于蛋白質(zhì)含量的測定[11]。本方法定量過程中無試劑加入,蛋白可回收,且方法簡便[17]。曹艷等[18]用紫外吸收法測定了半夏總蛋白含量,結(jié)論是由于不同樣品中干擾成分差異較大,致使280 nm紫外吸收法的準(zhǔn)確性稍差。故本實驗只適用于總蛋白的含量測定。因此,就含有大量復(fù)雜成分的中藥材中蛋白質(zhì)含量測定而言,最好是先進(jìn)行蛋白純化后在用紫外分光光度法測定。
　　
　　6 其他方法
　　
　　隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的深入發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)在基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥學(xué)研究中得到廣泛的利用,近年來也應(yīng)用于中藥材鑒別和蛋白質(zhì)的半定量。如在二維電泳基礎(chǔ)上的染色方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量是應(yīng)用較多的方法之一。唐任能[19]等采用SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳和BCA蛋白含量測定法比較了鹿茸、鹿托盤、鹿骨水溶性總蛋白差異。結(jié)論是SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳法及BCA蛋白含量測定法是鑒別鹿茸、鹿托盤及鹿骨有效方法。另外,利用凱氏定氮法對板藍(lán)根、南板藍(lán)根和大青葉的生藥和相應(yīng)的新鮮植物組織中的總蛋白含量進(jìn)行測定,提取液中的蛋白質(zhì)組分應(yīng)用SDS2PAGE電泳進(jìn)行分析,證實了三種藥材的蛋白質(zhì)種類和含量有一定差別,且同種藥材的新鮮植物組織和生藥蛋白質(zhì)組分在含量和種類上有明顯差別[20]。
　　
　　7 結(jié)束語
　　
　　總之,雖然蛋白質(zhì)含量的測定方法很多,但是,還沒有一個完美的測定中藥材中蛋白質(zhì)含量的方法。在選擇方法時應(yīng)考慮實驗對測定所要求的靈敏度和精確度;中藥材中蛋白質(zhì)的性質(zhì);中藥材中存在的干擾物質(zhì);測定所要花費(fèi)的時間等各種因素。在選擇測定方法時,可根據(jù)實驗要求和實驗室條件決定,從而選出適合且誤差較小較準(zhǔn)確的方法。
　　
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