[摘要]湖北貝母為傳統(tǒng)中藥，然而《Flora of China》將其基原植物湖北貝母Fritillaria hupehensis歸并于天目貝母F.monantha項(xiàng)下。該實(shí)驗(yàn)采用分子系統(tǒng)學(xué)方法，以川百合Lilium davidii為外類群，用核基因ITS序列和葉綠體基因rpl16序列、matK序列等3個(gè)片段對(duì)湖北貝母及其近緣類群天目貝母F.monantha、安徽貝母F. anhuiensis等進(jìn)行聯(lián)合建樹分析，對(duì)湖北貝母植物的系統(tǒng)位置進(jìn)行了探討，為湖北貝母藥材的安全使用提供分子證據(jù)。結(jié)果顯示，分子系統(tǒng)樹上，3種貝母各自的居群聚為一支，之后天目貝母與安徽貝母聚為一支，最后與湖北貝母聚為一支。表明湖北貝母與天目貝母的親緣關(guān)系可能要遠(yuǎn)于安徽貝母與天目貝母之間的關(guān)系，因此不適宜將湖北貝母歸并于天目貝母。
　　[關(guān)鍵詞]湖北貝母； 天目貝母； 安徽貝母； ITS； rpl16； matK
　　貝母為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有清熱化痰，止咳散結(jié)的功效，2010年版《中國(guó)藥典》^[1]中記載了5個(gè)品種的貝母類藥材，分別是川貝母、浙貝母、湖北貝母、伊貝母和平貝母，涵蓋了貝母屬植物10種1變種。貝母屬植物主要分布于北半球的溫帶地區(qū)，全世界130多種，中國(guó)有20多種，除《中國(guó)藥典》記載的種類外，在中國(guó)民間，其余貝母屬物種也多作為貝母類藥材的代用品使用。然而，由于形態(tài)性狀變異復(fù)雜，加之可能存在的種間雜交^[2-3]，使得該屬，特別是東亞地區(qū)物種分類處理并不十分清晰，這直接導(dǎo)致了藥材使用上的不便，如藥材湖北貝母的基原植物湖北貝母Fritillaria hupehensis為《中國(guó)藥典》2010年版所收錄，中文版《中國(guó)植物志》^[4]也承認(rèn)該種的成立，然而隨后《中國(guó)植物志》的同一作者卻出版了截然不同的意見(jiàn)，陳心啟等^[3]在討論長(zhǎng)江中下游地區(qū)的貝母屬分類時(shí)，認(rèn)為湖北貝母的性狀變異幅度在廣義的天目貝母F.monantha性狀變異范圍內(nèi)，進(jìn)而在2000年出版的《Flora of China》中將湖北貝母作為天目貝母的異名處理。這一處理是建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上的，是否合理應(yīng)該得到更多其他領(lǐng)域的數(shù)據(jù)支持，有待進(jìn)一步深入研究探討。
　　近十幾年來(lái)，隨著分子直接測(cè)序技術(shù)的普及，DNA序列片段已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于植物系統(tǒng)學(xué)的研究。ITS為核核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，具有較快的進(jìn)化速率，適于用來(lái)解決一些較低分類階元的問(wèn)題，應(yīng)用最為廣泛。葉綠體基因?yàn)閱慰截惢�，有利于系統(tǒng)樹的構(gòu)建。rpl16是cpDNA中進(jìn)化速率最快的內(nèi)含子之一，一般用于較低分類階元或近緣類群間^[5]。matK是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進(jìn)化最快的基因之一，也是近年中分子系統(tǒng)發(fā)育研究中使用頻率最高葉綠體片段之一^[6]。在國(guó)外尤其是中東地區(qū)，有關(guān)貝母屬分子系統(tǒng)的研究較為深入，但國(guó)內(nèi)這方面的報(bào)道還很少見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)外貝母屬分子系統(tǒng)學(xué)研究基礎(chǔ)^[7]選擇ITS，rpl16，matK 3個(gè)序列片段，對(duì)中國(guó)貝母屬下的部分植物開展分子系統(tǒng)學(xué)研究，焦點(diǎn)集中于與天目貝母和湖北貝母親緣關(guān)系較近的幾個(gè)物種，以期利用分子證據(jù)解決分類系統(tǒng)難題，同時(shí)也為貝母類藥材基源的準(zhǔn)確分類和應(yīng)用提供更多的證據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 樣品采集 用于本實(shí)驗(yàn)中湖北貝母、天目貝母及親緣關(guān)系較近的貝母屬植物均采自模式產(chǎn)地的野外或栽培居群，為硅膠干燥的新鮮葉片，可以較好的代表該種貝母植物，來(lái)源見(jiàn)表1。植物標(biāo)本由北京藥用植物研究所張本剛研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所資源中心。另外伊貝母以及作為外類群分析用的川百合序列來(lái)源于GenBank。
　　1.4 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 2720PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR酶采用北京艾德萊生物科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix。
　　PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：12.5 μL Master Mix，引物（ITS 2.5 μmol·L^-1；rpl16，matK 5 μmol·L^-1） 各1，2 μL總DNA樣品，8.5 μL ddH2O。
　　PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性（ITS 3 min；rpl16，matK 5 min）；94 ℃變性1 min，退火1 min（ITS 58 ℃；rpl16 54 ℃；matK 53 ℃ ），72 ℃延伸（ITS，rpl16 2 min；matK 2.5 min）；循環(huán)數(shù)（ITS 32；rpl16，matK 35 ）；72 ℃延伸（ ITS 5 min；rpl16，matK 7 min）；4 ℃保存。
　　1.5 序列測(cè)定 PCR 產(chǎn)物的純化和序列測(cè)定均由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成。 PCR 產(chǎn)物直接雙向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR引物。為保證測(cè)序順利，部分樣品的matK序列加測(cè)了中間引物。
　　1.6 序列分析 所測(cè)序列用CodonCode Aligner 3.7.1（Condon Code Co.，Germany）進(jìn)行校對(duì)拼接，然后用MEGA5.2對(duì)其與從GenBank中下載的序列進(jìn)行比對(duì)。以川百合為外類群，采用對(duì)最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony， MP）、最大似然法（maximum likelihood， ML）對(duì)3個(gè)序列進(jìn)行聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)樹：最大簡(jiǎn)約樹的構(gòu)建采用PAUP4.0b10進(jìn)行，使用啟發(fā)式搜索，TBR分支交換算法；最大似然樹的構(gòu)建采用MEGA5.2進(jìn)行，使用T-3-P + G的模型。最大似然使用的模型由MEGA5.2計(jì)算所得。用靴帶分析（bootstrap）1 000次重復(fù)檢驗(yàn)分支的可靠性，空缺（gap）始終做缺失（missing）處理。
　　2 結(jié)果與分析

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