摘要：根據(jù)玉米內(nèi)源ZEIN基因建立了茶葉中摻雜玉米的普通PCR和實時熒光PCR檢測方法。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)CTAB法適合提取茶葉樣品基因組DNA，實時熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%，普通PCR能達(dá)到1%，實時熒光PCR是普通PCR的10倍。兩種方法都能達(dá)到檢測要求。
　　關(guān)鍵詞：茶葉（Camellia sinensis）；玉米（Zea mays）；普通PCR；實時熒光PCR；檢測方法
　　中圖分類號：Q78；S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5615-03
　　目前，我國的茶葉（Camellia sinensis）年消費量已高達(dá)66萬t，人均飲茶量0.45 kg/年。茶對我國的社會歷史文化和現(xiàn)實生活都產(chǎn)生了重要影響[1]。茶葉質(zhì)量安全主要包括茶葉摻假、農(nóng)藥殘留、重金屬污染、有害微生物污染、磁性物和粉塵污染等因素[2，3]。其中茶葉中摻假的問題近年來越發(fā)嚴(yán)重，一些不法商販為了獲取高額利潤在茶葉中摻雜各種谷類物質(zhì)，以次充好，以假冒真。茶葉摻假的方式有：以類似茶葉的其他植物葉冒充茶葉；在真茶葉中摻入假、次茶葉；曬干飲用過的茶葉重新銷售等[4]。此外，茶葉中還出現(xiàn)了摻淀粉、甘薯粉、面粉或其他谷類淀粉加水、加熱促成淀粉糊，于茶葉初制或再加工過程中加入，其目的或是將末茶重新造形，促成條狀；或是將粗老茶特別是回籠茶（泡過的茶葉）揉成條，并增進(jìn)重實感；或是利用淀粉糊的黏性，摻入一些沙土、木灰、煤屑等以增重；或上述摻偽兼而有之[5]。
　　PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高的特點[6]，已廣泛應(yīng)用于食品、飼料中外源成分的檢測。本研究根據(jù)玉米（Zea mays）內(nèi)源ZEIN基因建立了茶葉中摻雜玉米的普通PCR和實時熒光PCR檢測方法，以期能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出茶葉中摻雜的玉米。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料與儀器
　　茶葉和玉米購自寧波市歐尚超市散裝商品（樣品在小型食品加工機(jī)中充分加工成細(xì)粉）。Taq DNA聚合酶和dNTPs等PCR試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
　　1.2 基因組DNA的提取
　　稱取含有10%玉米的茶葉樣品200 mg和純玉米樣品20 mg分別采用標(biāo)準(zhǔn)CTAB法[7]、改良CTAB法[8]和試劑盒法提取兩種樣品基因組DNA，用U-0080D型生物分光光度計測定基因組DNA濃度。
　　1.3 不同濃度梯度玉米的茶葉樣品基因組DNA的提取
　　將玉米樣品摻入到茶葉中，分別配制成濃度為10.0%、3.0%、1.0%和0.1%的茶葉樣品，并利用標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取基因組DNA，用U-0080D型生物分光光度計測定基因組DNA濃度。
　　1.4 PCR 擴(kuò)增
　　1）實時熒光PCR擴(kuò)增[9]。實時熒光PCR擴(kuò)增體系參照One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit說明。20 μL反應(yīng)體系為：20 μmol/L 上、下游引物各0.4 μL、20 μmol/L熒光探針0.8 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、2×TaKaRa Premix Ex Taq 10.0 μL、Rnase-free water 4.0 μL，DNA模板4.0 μL。每樣品設(shè)一個平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對照與空白對照。反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)。
　　2）普通PCR擴(kuò)增[10，11]。普通PCR反應(yīng)體系為：20 μmol/L上、下游引物各0.4 μL、Rnase-free water 5.2 μL、2×Taq Mastermix 10.0 μL，最后加入4.0 μL DNA模板，總體積20 μL。每樣品設(shè)一個平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對照與空白對照。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。
　　實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)束后在ABI Prism 7000中觀察并記錄結(jié)果；普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在GelDoc-EQ（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。
　　2 結(jié)果與分析
　　2.1 3種方法提取含10.0%玉米的茶葉樣品基因組DNA濃度和純度
　　由表1可知，試劑盒法提取的基因組DNA濃度較低，純度與另外兩種方法相差不大，改良CTAB法提取的基因組DNA的濃度和純度比標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取的基因組DNA的濃度和純度都要高，但相差不大。
　　2.2 茶葉樣品普通PCR和實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果
　　3種提取方式都有清晰而明顯的擴(kuò)增條帶，其中標(biāo)準(zhǔn)CTAB法得到的基因組DNA擴(kuò)增條帶最亮（圖1A）。標(biāo)準(zhǔn)CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA都有明顯的擴(kuò)增曲線（圖1B）。結(jié)合DNA濃度檢測結(jié)果，3種方法提取到的基因組DNA純度相近，但標(biāo)準(zhǔn)CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA濃度更高。而標(biāo)準(zhǔn)CTAB法更加簡潔，所用時間更短，因此確定了最適合的提取方法為標(biāo)準(zhǔn)CTAB法。
　　含1.0%、3.0%和10.0%玉米的茶葉樣品DNA有擴(kuò)增條帶，而含0.1%玉米的基因組DNA沒有擴(kuò)增條帶（圖2A），因此普通PCR能達(dá)到的檢測靈敏度為1.0%。含0.1%、1.0%、3.0%和10.0%玉米的基因組DNA都有顯著擴(kuò)增曲線（圖2B），因此實時熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%，是普通PCR的10倍。
　　3 小結(jié)與討論
　　本研究以建立茶葉中摻雜玉米成分的普通PCR和實時熒光PCR兩種檢測方法為目標(biāo)，優(yōu)化了核酸提取的方法。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取的DNA純度和得率都較高；改良CTAB法提取的DNA純度和得率也都較高，與標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取的DNA純度和得率差異不大，但是其耗費時間更長，所用試劑更多；試劑盒法提取的DNA雖然純度和其他兩種方法的差異不大，所用時間更短，但是其得率不高且成本較高。因此確定了標(biāo)準(zhǔn)CTAB法為最適合的核酸提取方法。實時熒光PCR方法檢測茶葉中摻雜玉米成分的優(yōu)點在于：①對玉米目的基因進(jìn)行擴(kuò)增后，不再需要凝膠電泳檢測，縮短了檢測時間，且不再需要接觸到EB；②準(zhǔn)確性很高，不容易出現(xiàn)假陽性，特異性更強(qiáng)[12]。實時熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%，普通PCR能達(dá)到1.0%，實時熒光PCR是普通PCR的10倍。

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