北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)跨學(xué)科論壇

　　現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)新的研究技術(shù)

　　尹長(zhǎng)城 教授

　　北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物物理系

　　英杰交流中心二層第一會(huì)議室

　　Cryo-electron Microscopy –An Emerging Technique in Structural Biology

　　Pro. Yin Chang-cheng

　　Department of Biophysics ,School of Basic Medical Sciences, Peking University

　　主持人講話:首先歡迎各位同學(xué)來(lái)參加我們今天的講座。我先向大家介紹一下北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)跨學(xué)科研究中心的情況，原北京大學(xué)于原北京醫(yī)科大學(xué)合并后，在韓啟德院士的積極倡導(dǎo)下，我們成立了北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)跨學(xué)科研究中心，招收跨專(zhuān)業(yè)的研究人才。韓校長(zhǎng)相信，以?xún)尚：喜�為契機(jī)，我們新的北京大學(xué)一定能發(fā)揮自身優(yōu)勢(shì)，在二十一世紀(jì)培養(yǎng)出新興學(xué)科領(lǐng)域的拔尖人才。從上個(gè)學(xué)期開(kāi)始，我們舉辦了這個(gè)跨學(xué)科論壇，我們邀請(qǐng)的都是在各自領(lǐng)域作出一定成績(jī)的年輕學(xué)者來(lái)給大家作帶有科普性質(zhì)的報(bào)告，希望這些報(bào)告對(duì)我們這些未來(lái)的跨學(xué)科人才有所啟發(fā)。下面我們就歡迎醫(yī)學(xué)部生物物理系的尹長(zhǎng)城教授開(kāi)始他今天的報(bào)告。

　　尹長(zhǎng)城:

　　很高興來(lái)到北大本部,與新一代的莘莘學(xué)子,未來(lái)的跨學(xué)科人才進(jìn)行交流.我是最近剛從英國(guó)回到祖國(guó).我在1990年出國(guó),先在瑞士做了一年的訪問(wèn)學(xué)者,然后在英國(guó)劍橋大學(xué)Medical Research Center醫(yī)學(xué)研究中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室獲得博士學(xué)位,又在英國(guó)做了兩屆博士后工作.最近看到國(guó)內(nèi)的形勢(shì)朝著越來(lái)越好的方向發(fā)展，我覺(jué)得大有用武之地，就決定回國(guó)發(fā)展。我在英國(guó)時(shí)是主要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的工作，所用的手段就是今天介紹的冷凍電子顯微鏡。冷凍電子顯微鏡是一項(xiàng)新興技術(shù)，近幾年得到迅速的發(fā)展，在研究大分子方面發(fā)揮重要作用。所以如果大家對(duì)研究生物學(xué),生物大分子方面有興趣，就要用好此項(xiàng)技術(shù)。

　　首先我向大家簡(jiǎn)單的介紹一下背景。

　　我們看一下什么是結(jié)構(gòu)生物學(xué)? 結(jié)構(gòu)生物學(xué)主要是用物理的手段,用X-射線晶體學(xué),核磁共振波譜學(xué),電鏡技術(shù)等物理學(xué)技術(shù)來(lái)研究生物大分子的功能和結(jié)構(gòu).來(lái)闡明這些大分子相互作用中的機(jī)制。大家可以看到在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)和功能的研究技術(shù)，沒(méi)有這些技術(shù)，就沒(méi)有結(jié)構(gòu)生物學(xué)。

　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)階段:結(jié)構(gòu)生物學(xué)起源于上世紀(jì)五十年代眾所周知的 Waston Crick 發(fā)現(xiàn)了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，建立DNA的雙螺旋模型。60年代 當(dāng)時(shí)的開(kāi)文迪許實(shí)驗(yàn)室的M.Perutz J.Kendrew 用X-射線晶體衍射技術(shù)獲得了球蛋白的結(jié)構(gòu).由于X射線晶體衍射技術(shù)的應(yīng)用，使我們可以在晶體水平研究大分子的結(jié)構(gòu)，在分子原子基礎(chǔ)上解釋了大分子.由于他們開(kāi)創(chuàng)性的工作，Waston ,Crick獲得了1962年的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),M.Pertt和J.Kendrew獲得了同年的化學(xué)獎(jiǎng).從那時(shí)起，技術(shù)的發(fā)展就成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展最重要的決定因素。60到70 年代,在同一實(shí)驗(yàn)室的他們又發(fā)展了電子晶體學(xué)技術(shù) ，當(dāng)時(shí)的研究對(duì)象主要是有序的,對(duì)稱(chēng)性高的生物體系，如二維的晶體和對(duì)稱(chēng)性很高的三維晶體。

70-80年代 ，多維核磁共振波譜學(xué)的發(fā)明使得在水溶液中研究生物大分子成為可能,水溶液中的生物大分子更接近于生理狀態(tài).最近二十年，80年代到本世紀(jì)初,冷凍電子顯微鏡的發(fā)明,這種技術(shù)的發(fā)明使我們不僅能夠研究生物大分子在晶體狀態(tài)和溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，而且能夠研究研究復(fù)雜 的大分子體系(molecular complex)超分子體系，這就是細(xì)胞器和細(xì)胞.可見(jiàn)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展過(guò)程經(jīng)歷了從結(jié)晶到溶液再到大分子體系,超分子體系,如核糖體(ribosome),病毒,溶酶體(lysosome),線粒體等.

　　 為什么要研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)?首先:結(jié)構(gòu)決定功能，說(shuō)到底就是一個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)決定功能 ，因此如果要了解一個(gè)分子的功能首先要知道三維結(jié)構(gòu).人類(lèi)基因組計(jì)劃(Human Genome Plan, HGP )完成后,為我們提供了大量的基因組序列。但是基因只給出了一個(gè)線性的序列,一個(gè)脫氧核苷酸的序列，是一個(gè)間接的信息；
而要知道更進(jìn)一步的信息，必須要測(cè)定蛋白質(zhì).這就像在一個(gè)電話本上,你只能夠找到人的電話號(hào)碼,但這個(gè)人的職業(yè)身份外觀和其他具體情況是不能知道的.基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄,翻譯成蛋白質(zhì), 再經(jīng)過(guò)翻譯后的磷酸化,糖基化等修飾,蛋白質(zhì)折疊,多亞基,多復(fù)合體還要進(jìn)行組裝,最后才能形成有功能的單位.(gene --transcription- translation —processing —folding —assembling —function unit)所以這些信息這樣一系列的過(guò)程是不可能只從單一的基因序列中得到，必須研究這些過(guò)程中分子的結(jié)構(gòu)和這些大分子的相互作用，到底是發(fā)生了什么變化，這些都要用到結(jié)構(gòu)生物學(xué)。另外，結(jié)構(gòu)是進(jìn)行其他很多研究的基礎(chǔ):藥物設(shè)計(jì),基因修飾,疫苗研制,人工蛋白質(zhì)構(gòu)建等。比如知道了一個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)，你就可以根據(jù)它的結(jié)構(gòu)特性來(lái)設(shè)計(jì)藥物，作為受體，讓一個(gè)小分子特異性的與它相結(jié)合，這是單個(gè)DNA序列不可能完成的。當(dāng)然知道了它的結(jié)構(gòu)，它的活性部位，酶活性中心就可以得知，比如得知離子通道的氨基酸組成，就可以進(jìn)一步研究通道開(kāi)關(guān)過(guò)程中蛋白的具體變化。

對(duì)病毒來(lái)說(shuō),如果知道它的結(jié)構(gòu),知道它在感染細(xì)胞的時(shí)候與細(xì)胞作用的氨基酸，可以根據(jù)病毒的結(jié)構(gòu)來(lái)設(shè)計(jì)一些治療的藥物。另外你知道了氨基酸的組成，知道具體氨基酸在蛋白中發(fā)揮的具體作用，就可以設(shè)計(jì)出新型的蛋白質(zhì)， 具有新性能，比如原來(lái)的蛋白不穩(wěn)定，設(shè)計(jì)的新型蛋白就可以提高它的穩(wěn)定性,且可以維持蛋白原有活性。

　　 剛才講到在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中重要的一個(gè)工具就是物理學(xué)手段.今天我就來(lái)介紹這些物理學(xué)手段同時(shí)比較這些方法的優(yōu)缺點(diǎn).首先我們來(lái)看X-射線晶體學(xué)技術(shù)，這是唯一能給出高分辨率的技術(shù),他可以分辨到一個(gè)原子水平，這是X-射線晶體學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在測(cè)定一個(gè)大分子，最基礎(chǔ)的根據(jù)就是X－射線晶體學(xué)；
它的缺點(diǎn)是首先要拿到晶體,但是不是所有的生物大分子都能夠獲得晶體，有些大分子的復(fù)合物晶體獲得比較困難,所以有些大分子達(dá)不到測(cè)定的要求；
其次分子在晶體中往往是被鎖定于某一狀態(tài),晶體培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng),所得到的晶體往往是分子處于基態(tài),而分子功能的行使多發(fā)生在激發(fā)態(tài),過(guò)渡態(tài)，X－射線晶體技術(shù)很難捕捉的分子的功能狀態(tài)。

　　核磁共振衍射技術(shù)同樣具有高分辨率的特點(diǎn),僅次于X-射線晶體學(xué)技術(shù),另外可以在溶液中操作,接近生理狀態(tài),缺點(diǎn)是所作樣品的分子量要比較小,一般 在50KD以下,而且分子量越大所測(cè)到的譜線就越多，有時(shí)各譜線很難分辨，所以有時(shí)波譜不容易分辨.當(dāng)然隨著超導(dǎo)磁鐵的發(fā)展,有可能分子量向大分子挺進(jìn)，但還是有一定限制。另外核磁共振衍射技術(shù)的反應(yīng)體系是溶液,這對(duì)不溶的蛋白比較困難,如膜蛋白,很難溶解，需要用去垢劑才可溶解,這就使研究復(fù)雜化。在核磁共振衍射的觀察中,去垢劑會(huì)造成很大的噪音和假相.

　　與前兩種技術(shù)不同，以上兩種方法都是間接觀察,都是利用衍射譜.而冷凍電子顯微鏡是直接觀察生物大分子,是直接看到分子，因此這樣的性質(zhì)就決定分子越大反而越好，越利于觀察,因此原則上來(lái)講用冷凍電子顯微鏡觀察分子，分子的大小沒(méi)有上限,可用于復(fù)雜大分子,超分子體系。另外由于這種技術(shù)的特點(diǎn)，它可以捕捉到活化的過(guò)渡狀態(tài)，可以研究分子的功能狀態(tài).另外適于薄體系,二維平面。冷凍電子顯微鏡最大的缺點(diǎn)是低分辨率,最高只達(dá)到3埃米,這是很難達(dá)到的,而X-射線晶體學(xué)技術(shù)分辨率是1埃米,核磁共振衍射技術(shù)分辨率是2埃米.

　　提到冷凍電子顯微鏡，先介紹一下電子顯微鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的發(fā)展。最先應(yīng)用于研究大分子是起先于1950年。二十世紀(jì)五十年代,發(fā)明負(fù)染技術(shù),這種技術(shù)由于染料的顆粒比較大，染料不浸透樣品而是堆積在樣品表面,所以觀察到的不是分子本身而是外貌，因此它的分辨率限制在2納米.到了六十年代,劍橋大學(xué)的科學(xué)家發(fā)展了用電鏡來(lái)解釋結(jié)構(gòu)的理論，提出三維重構(gòu)理論,用于研究病毒,由于這一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性研究，他獲得了1982年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。七十年代,同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們?cè)谌�維結(jié)構(gòu)理論的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了生物電子晶體學(xué)理論，利用生物電子晶體學(xué)，他們就可以研究二維的高度有序的大分子 ，如二維結(jié)晶，分辨率達(dá)到0.7納米。

到了八十年代,快速冷凍技術(shù)的發(fā)明使分辨率提高到0.3納米,這個(gè)技術(shù)的發(fā)明導(dǎo)致的現(xiàn)在的電子顯微鏡的方面。可將氨基酸基團(tuán)在空間定位,進(jìn)行大概的結(jié)構(gòu)解析.八十年代到本世紀(jì)初,利用計(jì)算機(jī)迅速發(fā)展的契機(jī)，發(fā)展圖象處理技術(shù),可應(yīng)用于研究不是非常有序非結(jié)晶的生物體，大大提高了我們的研究進(jìn)程。

　　說(shuō)了半天，到底什么是冷凍電子顯微鏡?冷凍電子顯微鏡本質(zhì)上還是電子顯微鏡，特殊的地方在于冷凍,就是在處理樣品時(shí),對(duì)樣品進(jìn)行快速冷凍.我們知道用水緩慢冷凍,會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶,而快速冷凍,水就來(lái)不及結(jié)晶，會(huì)產(chǎn)生一種無(wú)序化的玻璃化狀態(tài),生物大分子被固定在這種無(wú)序的玻璃化狀態(tài)，即保持在某種天然狀態(tài).由于是生物樣品處于冷凍狀態(tài),所以必須用低溫觀察以保持,一般用低于液氮的溫度(-160攝氏度).然后記錄觀察晶體的圖象，記錄的圖象實(shí)際是分子二維的投影,不是分子三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖象處理,得到分子三維結(jié)構(gòu),繼而根據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析功能,比如對(duì)于一個(gè)抗體，可知抗體與抗原的結(jié)合的部位,觀察結(jié)合后發(fā)生的變化.

　　冷凍電子顯微鏡是如何捕捉狀態(tài)的?實(shí)際操作就是要用樣品鉗,在銅網(wǎng)上加樣品,將多余的；
液體吸去，由于表面張力形成一層薄膜，同時(shí)將樣品放到低溫的液體中比液氮還低的乙烷，溫度是-150攝氏度,然后液化，固化，樣品固定進(jìn)行低溫觀察。

　　為什么使用冷凍電子顯微鏡? 冷凍電子顯微鏡的顯著優(yōu)點(diǎn)在于將樣品保持在水相,保持天然狀態(tài),第二點(diǎn)就是可以得到高分辨率結(jié)構(gòu);另外由于這種技術(shù)的引進(jìn)，可將分子在不同狀態(tài)下凍結(jié),可以捕捉到過(guò)渡態(tài)，基態(tài)過(guò)渡態(tài)均可觀察; 另外這種技術(shù)可用于觀察超分子體系.

　　剛才說(shuō)了在電鏡中所觀察到的不是分子的三維結(jié)構(gòu)，而是分子三維結(jié)構(gòu)在二維平面上的投影，作怎樣從投影反推回來(lái)算出它的三維結(jié)構(gòu)呢？這就是三維重構(gòu)理論。三維重構(gòu)理論運(yùn)用的數(shù)學(xué)原理：將一個(gè)密度函數(shù)進(jìn)行三維傅立葉變換，密度函數(shù)就變?yōu)轭l率函數(shù)。這樣一個(gè)三維信息就壓縮到一個(gè)二維平面上,這就是電鏡照片的情況。取一個(gè)中心截面,那么一個(gè)投影的富氏變換就相當(dāng)于一個(gè)三維富氏變換的中心截面。根據(jù)這樣的原理，就可以根據(jù)投影得到的信息通過(guò)三維變換來(lái)算出分子在的結(jié)構(gòu)。比如,分子在溶液中不同的取向,分子直立或躺倒的狀態(tài)，在電鏡觀察時(shí)，投影是不一樣的，然后將投影進(jìn)行傅立葉變換，理論上說(shuō),如果得到足夠多的投影,就是得到分子在所有方向上的投影,然后進(jìn)行富氏變換,就可得到三維結(jié)構(gòu).這就是三維重構(gòu)的具體原理。根據(jù)樣品臺(tái)的特點(diǎn)，在實(shí)際操作中有不同的方法。對(duì)于二維結(jié)構(gòu),怎么得到不同的截面呢？可以從水平開(kāi)始,傾斜不同角度,以得到投影。這樣的技術(shù)存在一個(gè)問(wèn)題：由于樣品臺(tái)傾斜角度的限制,只能在0-70度之間轉(zhuǎn)動(dòng),不可能從0度傾斜到90度，所以70-90度之間沒(méi)有信息,這就是一個(gè)視錐問(wèn)題,分辨率只有3-5埃米.第二種情況就是對(duì)于在溶液中的分子,分子取向是隨機(jī)分布的,所以只要分子數(shù)量足夠多,所觀察的現(xiàn)象就可得到在不同方向上的投影,也不必旋轉(zhuǎn)載物臺(tái),不必傾斜角度.以上二維結(jié)構(gòu)和溶液中分子的觀察,都是疊加后取平均分布結(jié)果.還有一種情況就是對(duì)于大的物體,如細(xì)胞器,細(xì)胞,由于存在個(gè)體差異,不可能用平均分布,這時(shí)就要攝取一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行照相,進(jìn)行不同角度傾斜,同樣由于視錐問(wèn)題,70-90度之間沒(méi)有數(shù)據(jù).

　　最后來(lái)介紹一下冷凍電子顯微鏡的具體應(yīng)用:首先冷凍電子顯微鏡應(yīng)用于難以用X-射線晶體學(xué)技術(shù)和核磁共振衍射技術(shù)研究的大分子.比如一些纖維狀的堆積體,我們知道朊蛋白(prion)是導(dǎo)致瘋牛病(mad cow disease)的分子,這種蛋白的晶體很難幾乎不可能培養(yǎng),也很難獲得均勻的溶液.這樣的分子恰好可以用冷凍電子顯微鏡技術(shù)來(lái)研究。再如,對(duì)早老性癡呆癥(alzheimer’s disease)患者體內(nèi)淀粉樣蛋白(beta-amyloid)沉積的結(jié)構(gòu)研究，(點(diǎn)擊此處閱讀下一頁(yè))

　　它就是一種纖維狀堆積體,在去年分子生物學(xué)雜志(journal of molecular biology)發(fā)表的一篇文章:先用圖象記錄,獲取纖維,看到4.8埃米的規(guī)則間隔,可見(jiàn)冷凍電子顯微鏡可以很好的保存樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu).然后用富氏變換,通過(guò)光學(xué)衍射得到圖譜,發(fā)現(xiàn)beta-amyloid在4.76埃米處有一個(gè)強(qiáng)點(diǎn),在9.6埃米處也有一個(gè)強(qiáng)點(diǎn),而4.76埃米恰好是一個(gè)beta片層的厚度,這表明該蛋白以beta片層為一個(gè)重復(fù)周期,而9.6埃米是兩個(gè)beta片層反平行排列的厚度,隨后經(jīng)過(guò)重構(gòu)圖象根據(jù)間隔來(lái)判斷該蛋白是由beta片層組成反平行排列的纖維狀蛋白.不僅是一些不溶的纖維可以用于冷凍電子顯微鏡的研究，某些可溶性的蛋白,在某些條件下也會(huì)變成不溶狀態(tài),如胰島素(insulin)通常情況下是可溶,但也可形成纖維狀聚集物.用酸處理,胰島素會(huì)變成螺旋狀纖維聚積物,經(jīng)冷凍電子顯微鏡等觀察發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)是由beta片層組成一根纖維,然后相互纏繞而成螺旋狀.為什么經(jīng)酸處理,胰島素從可溶狀態(tài)變成不可溶?這是因?yàn)橐葝u素的雙鏈在酸性條件下，即ph值小于七的情況下,構(gòu)象發(fā)生變化,從有序變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài),經(jīng)過(guò)重折疊,兩條鏈變?yōu)閎eta片層的反平行結(jié)構(gòu).

　　第二個(gè)應(yīng)用就是 冷凍電子顯微鏡可用于觀察分子,物質(zhì)的不同功能狀態(tài)，研究不同的功能蛋白.如離子通道的開(kāi)放和關(guān)閉,開(kāi)關(guān)的瞬間停留的非常短,如乙酰膽堿的受體,阿爾法螺旋發(fā)生順時(shí)旋轉(zhuǎn)開(kāi)關(guān)從關(guān)閉到開(kāi)放，加入乙酰膽堿以后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.如肌肉收縮,加入ADP,肌肉束水平發(fā)生向上的三十度的旋轉(zhuǎn),這樣一個(gè)轉(zhuǎn)變使肌肉發(fā)生運(yùn)動(dòng)，這就是肌肉收縮的分子機(jī)制.大家學(xué)過(guò)生物化學(xué)都知道，蛋白合成循環(huán),生化學(xué)家只是對(duì)生物化學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究,那么結(jié)構(gòu)生物學(xué)家就希望能看到這種循環(huán),實(shí)際上是怎樣發(fā)生的。將核糖體(ribosome),信使RNA(Mrna),轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和多肽，然后進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)際的情況與生物化學(xué)學(xué)家得到的結(jié)論是吻合的，這就從結(jié)構(gòu)上證明生物化學(xué)家得到的結(jié)論是正確的。而且可以具體觀察到，在蛋白質(zhì)合成的過(guò)程中，每一步的具體過(guò)程，如核糖體是如何與信使RNA作用的。

　　第三方面的應(yīng)用就是冷凍電子顯微鏡可以為大分子測(cè)定提供初始模型。比如最近對(duì)核糖體的結(jié)構(gòu)解析,開(kāi)始先用冷凍電子顯微鏡觀察,只達(dá)到20埃米的程度；
后來(lái)用X-射線晶體學(xué)技術(shù),這只能是衍射,只得到振幅,而沒(méi)有相位信息,只能引進(jìn)重金屬獲得,但核糖體這種大分子太大,引進(jìn)幾個(gè)重金屬作用不大.后來(lái)將冷凍電子顯微鏡與X-射線晶體學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái),利用冷凍電子顯微鏡得到的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將它引入到X－射線衍射技術(shù)中，利用相位與振幅信息相結(jié)合，可以得到7.8埃米的分辨率；
2001年,分辨率已提高至5.5埃米,可就可以研究各組分的分布和相互作用.

　　最后就是對(duì)復(fù)雜體系的研究:如噬菌體(phage)侵染細(xì)胞時(shí)的打孔裝置,十分復(fù)雜,幾乎不可能獲得晶體而且太大不能用核磁共振來(lái)研究,所以將各組分提取,分別用X-射線晶體學(xué)技術(shù)等獲得單個(gè)組分的結(jié)構(gòu),采取個(gè)個(gè)擊破的方法,再用冷凍電子顯微鏡重新組合,這一結(jié)果發(fā)表在今年的<自然>(nature)上.打孔裝置接觸細(xì)胞的一端是beta片層管狀結(jié)構(gòu),DNA通過(guò)管子進(jìn)入細(xì)胞.再如,對(duì)病毒與受體相互作用的研究,結(jié)晶是不可能的, 冷凍電子顯微鏡對(duì)復(fù)合物觀察,發(fā)現(xiàn)受體有三個(gè)結(jié)構(gòu)域,細(xì)胞用一號(hào)結(jié)構(gòu)域域病毒作用,這對(duì)藥物設(shè)計(jì)有指導(dǎo)作用.

　　以上就是介紹冷凍電子顯微鏡的應(yīng)用與現(xiàn)狀，最后介紹一下未來(lái)的發(fā)展方向:我們知道人類(lèi)基因組計(jì)劃完成,大家就想向研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)方面進(jìn)軍,在這樣一個(gè)過(guò)程中冷凍電子顯微鏡起什么樣的作用呢？冷凍電子顯微鏡與X-射線晶體學(xué)技術(shù),核磁共振衍射技術(shù)結(jié)合,就可以解析復(fù)雜體系結(jié)構(gòu).因?yàn)閄-射線晶體學(xué)技術(shù),核磁共振衍射技術(shù)只能對(duì)單個(gè)組分進(jìn)行解析,要想得到復(fù)雜分子超分子體系的結(jié)構(gòu)，冷凍電子顯微鏡可以繪出密度圖，進(jìn)行整合。這是未來(lái)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方向。另外一個(gè)發(fā)展方向是與生物信息學(xué)的結(jié)合，可將特異性折疊建立數(shù)據(jù)庫(kù),然后一個(gè)復(fù)雜體系的結(jié)構(gòu)就可利用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)冷凍電子顯微鏡觀察得到的形態(tài)進(jìn)行分析，可將結(jié)構(gòu)域的信息放到大分子體系中。最后，看到分子在細(xì)胞中的實(shí)際工作,這是生物學(xué)家的一個(gè)夢(mèng)想,用 X-射線晶體學(xué)技術(shù),核磁共振衍射技術(shù)能看到分子，但只能在體外觀察,體內(nèi)的狀態(tài)無(wú)法觀察。而冷凍電子顯微鏡直接觀察,使這一夢(mèng)想有可能實(shí)現(xiàn),以分子特定結(jié)構(gòu)為標(biāo)記(signature)進(jìn)行動(dòng)態(tài)時(shí)空觀察研究作用功能.

　　提問(wèn):

　　 問(wèn)題:尹老師您好，質(zhì)譜質(zhì)譜連用技術(shù)也是目前在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方面的常用技術(shù)，您覺(jué)得它與冷凍電子顯微鏡技術(shù)的比較如何？

　　答：質(zhì)譜質(zhì)譜連用技術(shù)是將分子打成小片段,結(jié)構(gòu)已知然后組合.適用于分子,單個(gè)亞基；
然而對(duì)于復(fù)雜體系不適用.

　　問(wèn)題:您能簡(jiǎn)單介紹一下冷凍電子顯微鏡在國(guó)際上的應(yīng)用情況嗎？

　　答：因?yàn)闀r(shí)間倉(cāng)促,在剛才沒(méi)有來(lái)得及介紹 .在國(guó)際上冷凍電子顯微鏡的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛。在歐洲,劍橋大學(xué)的MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，英國(guó)牛津大學(xué)，帝國(guó)理工大學(xué)，歐洲分子生物學(xué)研究所多有冷凍電子顯微鏡的設(shè)備。在美國(guó)有國(guó)立衛(wèi)生研究院，BERKLEY國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，BAYLAR醫(yī)學(xué)院，PURDUE大學(xué)也有。那么大家一定要問(wèn)，為什么象哈佛，耶魯，普林斯頓這樣的一流大學(xué)沒(méi)有建立冷凍電子顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室，那時(shí)因?yàn)楫?dāng)時(shí)他們沒(méi)有預(yù)見(jiàn)到這項(xiàng)技術(shù)的重要性和發(fā)展之快。國(guó)內(nèi)北京大學(xué)，清華大學(xué)，中國(guó)科學(xué)院生物物理所，國(guó)家電鏡實(shí)驗(yàn)室都準(zhǔn)備和正在建立這樣的實(shí)驗(yàn)室，我回國(guó)的目的就是要在國(guó)內(nèi)建立冷凍電子顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室。清華大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院的生物物理所都已經(jīng)先后購(gòu)買(mǎi)了冷凍電子顯微鏡，但目前在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有一家單位能獨(dú)立開(kāi)展自己的工作，有的只是我們北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院與國(guó)外進(jìn)行合作研究。

　　問(wèn)題：冷凍電子顯微鏡與以前我們所說(shuō)的冷凍蝕刻技術(shù)有什么區(qū)別和聯(lián)系？

　　 答：冷凍蝕刻技術(shù)是將樣品進(jìn)行固定，然后用刀切割，研究膜蛋白。所得到的是所研究物體的表面形態(tài)，由于它的顆粒比較粗，所以只能觀察物體的表面形態(tài)，而不能到原則水平。而冷凍電子顯微鏡技術(shù)由于固定方法特殊，固定于玻璃狀態(tài)，不引入人工效應(yīng)，且切片的厚度有問(wèn)題。這種方法不要用染色，可以看到分子原子的狀態(tài)。

　　問(wèn)題：我想問(wèn)一個(gè)關(guān)于構(gòu)象的問(wèn)題。如果是球形蛋白，有一個(gè)凹洞，如果投影，會(huì)不會(huì)有影響對(duì)其形態(tài)觀察的可信度？

　　答：這位同學(xué)可能沒(méi)有完全理會(huì)我的報(bào)告，將三維信息壓縮至二維，不只是一個(gè)切面，不是信息的丟失。而且我們這在努力提高冷凍電子顯微鏡的分辨率：分辨率如果達(dá)到3埃米，就可以對(duì)基團(tuán)進(jìn)行空間定位，分辨率如果達(dá)到2埃米，可以看到碳原子，氧原子，可對(duì)重原子進(jìn)行空間定位，如果達(dá)到1埃米甚至可以看到氫原子，可以對(duì)輕原子進(jìn)行空間定位

　　 問(wèn)題：要進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察時(shí)如何做呢？

　　答：冷凍電子顯微鏡技術(shù)不可能用于連續(xù)觀察，只能是捕捉點(diǎn)的狀態(tài)，連續(xù)的動(dòng)態(tài)觀察最有效的還是核磁共振衍射技術(shù)，因?yàn)槭窃谌芤褐杏^察。

　　問(wèn)題：您剛才提到了視錐問(wèn)題，為解決70-90度不能觀察的視錐問(wèn)題，可否讓鏡子轉(zhuǎn)？

　　答：讓電子源來(lái)旋轉(zhuǎn)。理論上可能，但在實(shí)際中是不行的，電子源激發(fā)路徑很長(zhǎng)，不易控制， 但樣品容易控制，用計(jì)算機(jī)就可以很好的監(jiān)控。

　　問(wèn)題：對(duì)分子的適時(shí)監(jiān)控目前的辦法是什么？

　　答：要研究分子在細(xì)胞中的功能，X-射線晶體學(xué)技術(shù)要獲得結(jié)晶，核磁共振衍射技術(shù)要有水溶液體系，這兩項(xiàng)技術(shù)都不可能。目前只能觀察，用冷凍電子顯微鏡這一個(gè)辦法，也可用光鏡，但應(yīng)為可見(jiàn)光的波長(zhǎng)有限，需要標(biāo)記，只能看路徑，冷凍電子顯微鏡可用來(lái)看結(jié)構(gòu)變化。目前電鏡要求高真空，必須固定，所以不可能看連續(xù)的動(dòng)態(tài)，只能選不同的時(shí)間點(diǎn)固定，比如說(shuō)幾毫秒固定一次，在來(lái)模擬推測(cè)它的連續(xù)變換。

　　問(wèn)題：冷凍電子顯微鏡與掃描電鏡的區(qū)別在何處？

　　答：冷凍電鏡是透射電鏡，看物體內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)；
而掃描電鏡是利用探針掃描，對(duì)大分子不能掃到分子內(nèi)部，而是表面形貌，不可能是分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。如果是研究原子水平，沒(méi)有問(wèn)題。但一旦涉及到大分子，就要出現(xiàn)問(wèn)題了。

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