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2006年三諾獎花落美國:三諾獎

發(fā)布時間:2020-02-18 來源: 感恩親情 點擊:

  生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎沉默基因閃亮登場      1998年2月19日,兩位遺傳學(xué)家和同事在英國《自然》雜志上發(fā)表了一篇題為《雙鏈RNA在秀麗隱桿線蟲中有力而獨特的遺傳干擾作用》的論文。其中一位是華盛頓卡內(nèi)基研究所胚胎學(xué)部39歲的安德魯?菲爾,另一位是馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心38歲的克雷格?梅洛。
  2006年10月2日,瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院諾貝爾獎評審委員會宣布,2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎共同授予安德魯?菲爾和克雷格?梅洛,以表彰他們發(fā)現(xiàn)了“RNA干擾機制―雙鏈RNA沉默基因”。
  諾貝爾獎評審委員會的公報中稱:“他們的發(fā)現(xiàn)澄清了許多令人迷惑和矛盾的實驗結(jié)果,揭開了大自然控制遺傳信息流動的一種機制,他們開創(chuàng)了一個嶄新的研究領(lǐng)域!
  
  中心法則的困惑
  生命的遺傳信息儲藏在細胞核中的脫氧核糖核酸(DNA)中。DNA的信息被信使核糖核酸(mRNA)復(fù)制,mRNA再將這一指令送到生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)中。弗朗西斯?克里克(FranceCrick)是1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者,他將遺傳信息從DNA通過mRNA轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)的流動過程稱為分子生物學(xué)的中心法則。從消化食物的酶、大腦中接受信息的受體,到防御細菌的抗體,蛋白質(zhì)與生命的過程息息相關(guān)。
  人類基因組有約3萬個基因。然而,只有少部分基因在細胞中發(fā)揮作用。基因的表達主宰了蛋白質(zhì)的合作,這一過程由mRNA復(fù)制DNA信息的轉(zhuǎn)錄機制所控制。早在40多年前,法國諾貝爾獎獲得者雅各布(FrancoisJacob)和莫諾(JacquesMonod)發(fā)現(xiàn)了基因表達的基本調(diào)控機制。今天,我們知道這一機制主宰著從細菌到人類的整個進化過程,科學(xué)家們在此基礎(chǔ)上發(fā)展出基因技術(shù),也就是說將DNA序列注入細胞中生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)。
  上世紀(jì)90年代,分子生物學(xué)家們得到了一系列難以解釋的意外結(jié)果,其中最引人注目的是,生物學(xué)家們觀察到:為了增加矮牽;ɑò甑念伾疃,他們將一種形成花朵紅色的基因注入花中,結(jié)果不僅花朵的顏色沒有增加,而且花兒完全褪色,花瓣變成了白色。究竟是什么機制導(dǎo)致這種異,F(xiàn)象呢?科學(xué)家們?yōu)榇死_不已。
  
  
  發(fā)現(xiàn)的那一刻
  面對植物學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的一系列不可思議的基因沉默實驗結(jié)果,菲爾和梅洛決定研究基因的表達究竟是如何被控制的。菲爾當(dāng)時在卡內(nèi)基華盛頓研究所工作,他說,對實驗的嗅覺將他和梅洛引入這個領(lǐng)域。兩人對生命周期只有9天的秀麗隱桿線蟲的實驗研究揭開了這個謎底。
  他們將一種編碼肌肉蛋白質(zhì)的mRNA注入秀麗隱桿線蟲中,發(fā)現(xiàn)線蟲的行為并沒有由此產(chǎn)生什么變化。攜帶的這種遺傳密碼的mRNA被稱為“正義mRNA”,攜帶反遺傳密碼信息的mRNA則被稱為“反義mRNA”。兩人又將反義mRNA注入線蟲中,同樣沒有發(fā)生什么變化。但是,當(dāng)他們將正義和反義mRNA同時注入線蟲時,線蟲出現(xiàn)了奇特的顫搐運動。類似的運動在編碼這種肌肉蛋白質(zhì)的基因完全缺失的小鼠中出現(xiàn)過。梅洛回憶說:“這是發(fā)現(xiàn)的那一刻,雙鏈RNA沉默了基因!這是多么令人激動而有趣的現(xiàn)象。”
  為什么會出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢?原來,當(dāng)正義和反義mRNA相遇時,它們彼此糾纏形成雙鏈RNA。菲爾和梅洛推測:是這種雙鏈RNA分子沉默了攜帶了同樣遺傳信息的基因嗎?他們將攜帶另外幾種線蟲肌肉蛋白質(zhì)遺傳信息的雙鏈RNA分子注入線蟲體內(nèi)。在每次實驗中,攜帶某種遺傳密碼的雙鏈RNA總能沉默含有相同密碼的基因的表達,因此由這種基因編碼的蛋白質(zhì)就不再形成。
  在一系列簡單而出色的實驗后,菲爾和梅洛認(rèn)為,雙鏈RNA能抑制含同樣密碼的特定基因的表達,這種RNA干擾現(xiàn)象可在細胞間擴散甚至能遺傳。他們認(rèn)為這種RNA干擾是一種催化過程。他們的研究結(jié)果發(fā)表在1998年2月19日出版的《自然》雜志上。
  
  揭開謎底
  在此之后的幾年中,菲爾和梅洛開始研究單鏈RNA不能沉默基因的原因,他們揭開了雙鏈RNA干擾機制的秘密。
  雙鏈RNA被一種名為Dicer的蛋白質(zhì)識別并與之結(jié)合在一起,Dicer將雙鏈RNA切割成碎片般的小片段。之后,小片段與另一種名為RISC的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,RISC會去除雙鏈RNA小片段中的一個鏈,只留下單鏈RNA與自己在一起。結(jié)果,這種RISC復(fù)合體像偵探一樣探測mRNA分子,一旦mRNA與自己的RNA片段所攜帶信息匹配,RISC復(fù)合體就將它與自己結(jié)合起來,然后把它切割片斷并毀滅。對應(yīng)的基因就這樣被沉默了。
  RNA干擾是生命體尤其是低等動物對付病毒的一種自然防御機制。許多病毒含有雙鏈RNA遺傳密碼,當(dāng)這類病毒感染細胞時,它會向細胞注入它的RNA分子,這種分子立即與Dicer結(jié)合,RISC被激活,病毒RNA因此被降解,感染的細胞得以生存。除了有這樣的防御機制外,像人類這樣的高等動物還發(fā)展出包括抗體、殺手細胞和干擾素這類的免疫防御系統(tǒng)。
  
  拓展全新領(lǐng)域
  菲爾和梅洛的發(fā)現(xiàn)打開了嶄新的篇章。如今,RNA干擾技術(shù)已被用于調(diào)控人類基因的表達。我們身體中的幾百個基因可編碼一種名為microRNA的小RNA分子。這種小分子含有其他基因的幾種密碼,它能形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu),激活RNA干擾機制從而阻斷蛋白質(zhì)的合成。
  科學(xué)家認(rèn)為,RNA干擾技術(shù)不僅是研究基因功能的一種強大工具,不久的未來,這種技術(shù)也許能用來直接從源頭上讓致病基因“沉默”,以治療癌癥甚至艾滋病,在農(nóng)業(yè)上也將大有可為,在最近的動物實驗中,RNA干擾技術(shù)成功地沉默了小鼠體內(nèi)導(dǎo)致高膽固醇的基因。前景令人興奮,新機會還在不斷涌現(xiàn),但也有科學(xué)家警告RNA干擾的潛在危險,比如實驗也顯示它能致死小鼠。研究人員必須在臨床試驗中小心謹(jǐn)慎。
  盡管RNA干擾的應(yīng)用方興未艾,但梅爾的興趣仍然在基礎(chǔ)研究上。他說:“至今我們對這種機制還有許多不了解的地方。如今,看到如此之多不同領(lǐng)域的人都聚集在一起研究這種機制,這是多么激動人心的事!
  
  化學(xué)獎講述生命的故事
  
  1965年,18歲的羅杰?科恩伯格與父親阿瑟?科恩伯格和保羅?伯格(Paul Berg)合寫了一篇論文,這是一篇晦澀難懂的論文――《與結(jié)晶性酵母細胞色素b2相關(guān)的DNA異種性》,但這篇論文注定是一篇非凡的學(xué)術(shù)珍品,因為論文中的三位作者先后榮獲諾貝爾獎:
  
  老科恩伯格與他人分享1959年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎,柏格與另外兩人獲得1980年諾貝爾化學(xué)獎。2006年,諾貝爾化學(xué)獎授予羅杰?科恩伯格一人,以表彰他對真核轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)的研究,他獲獎的工作于2001年發(fā)表在美國《科學(xué)》雜志上。
  
  生命的故事
  今年的諾貝爾化學(xué)獎授予科恩伯格,因為他在分子水平上研究了儲存在細胞核基因中的信息如何被復(fù)制、轉(zhuǎn)送到細胞的其他地方,用以制造蛋白質(zhì),這個過程被稱為轉(zhuǎn)錄,他首次在真核細胞生物中拍攝到了生命中這個動態(tài)過程的真實照片。
  持續(xù)轉(zhuǎn)錄DNA中的遺傳信息是所有生命的中心過程。因為DNA分子位于細胞核中,它所攜帶的遺傳信息必須復(fù)制到信息RNA分子,再由它帶到細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的地方,蛋白質(zhì)構(gòu)建了生命的器官和功能。
  如果轉(zhuǎn)錄過程被干擾,那么細胞中蛋白質(zhì)的生產(chǎn)就會停止,生命就會死亡。比如,一種形狀如傘的毒菌有死亡之帽之稱,因為傘帽上的毒素會抑制在轉(zhuǎn)錄過程中起核心作用的RNA―聚合酶的功能,幾天后,當(dāng)毒素從腸擴散到肝和腎時,它們就被損害了。而且,包括癌癥、心臟病和各種不同炎癥的發(fā)生也與轉(zhuǎn)錄過程出現(xiàn)問題有關(guān)。
  身體中所有的細胞都含有相同的遺傳信息,但為什么不同的細胞總是各司其職呢?比如皮膚細胞負(fù)責(zé)皮膚細胞的更新、肝臟細胞負(fù)責(zé)肝臟的更新,原因是這些器官中遺傳信息的轉(zhuǎn)錄方式不同。要了解干細胞為何能分化成不同的細胞,必須深刻認(rèn)識遺傳信息的轉(zhuǎn)錄過程是如何被調(diào)控的,這也有助于在醫(yī)學(xué)上實現(xiàn)干細胞的全部潛能。
  DNA分子有4個基本的構(gòu)件,即堿基G、C、A、T,堿基對是由氫鍵聯(lián)結(jié)的一對互相匹配的堿基。RNA也是由相應(yīng)的堿基構(gòu)成。隱藏在這些分子中的遺傳信息是由這些堿基的排列方式?jīng)Q定的。因此,遺傳密碼僅僅由4個字母組成。
  DNA分子是由堿基對聯(lián)結(jié)起來的雙螺旋分子鏈。當(dāng)DNA雙螺旋分開成單鏈并以此創(chuàng)建RNA鏈的模板時,轉(zhuǎn)錄過程便開始了。一個基本的問題是:究竟是什么樣的機制保證RNA的堿基對按對應(yīng)于DNA單鏈的正確序列結(jié)合在一起?答案隱藏在一個控制這個過程的特定酶中:RNA―聚合酶。解開這個謎的人是科恩伯格。
  
  家學(xué)淵源承前啟后
  科恩伯格1947年出生于圣路易斯,是家中的長子,他有兩個弟弟。12歲時,他隨父親前往瑞典斯德哥爾摩領(lǐng)取諾貝爾獎,當(dāng)父親問他在圣誕節(jié)需要什么時,他說:“在實驗室待一個星期!
  小科恩伯格1967年畢業(yè)于哈佛大學(xué),1972年在斯坦福大學(xué)獲得博士學(xué)位,之后到英國劍橋跟隨諾貝爾獎獲得者亞當(dāng)?克魯格和弗朗西斯?克里克攻讀博士后,他的研究對象是真核生物細胞核中由核酸與蛋白質(zhì)組成的核酸復(fù)合物――染色質(zhì)。他的主要研究領(lǐng)域是生物化學(xué),研究對象是RNA―聚合酶。如今,他是斯坦福大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)教授。
  2001年,科恩伯格創(chuàng)建了第一張RNA―聚合酶的全動態(tài)照片。在這幅圖片中,如絲帶般雜亂的分子是RNA-聚合酶,它們支撐著單鏈DNA分子。這些聚合酶分子在保持DNA鏈處于正確位置時也創(chuàng)建了一個極小的“空穴”,這個空穴只允許與DNA鏈上的堿基配對的堿基進入RNA鏈,這樣,通過一個個的堿基配對,RNA鏈就像拼湊七巧板一樣形成了。
  諾貝爾獎的公告中稱:“這張照片真正革命性的地方是科恩伯格抓著了轉(zhuǎn)錄的過程。我們在這張照片中看到了RNA鏈的形成過程,DNA分子、聚合酶和RNA在這個過程中的精確位置。”
  這張圖片是怎么創(chuàng)建的呢?科恩伯格采用了一個絕妙的方法。在RNA鏈的形成過程中,他從溶液中取走其中一個必需的堿基對,導(dǎo)致RNA鏈在需要這個堿基對的插入時因找不到它而將轉(zhuǎn)錄過程停止,然后創(chuàng)建出這些分子的晶體,再用X射線拍照,利用這種照片,計算機計算出分子中原子的真正位置,這張圖片就是由一臺計算機這樣制作出來的。
  今天,為了描述一個生物分子而將它們制作成晶體并不是一件難事,然而,要在晶體中抓住一個化學(xué)反應(yīng)的瞬間卻異常困難,僅僅擁有良好的晶體學(xué)技術(shù)是不夠的。劍橋大學(xué)的轉(zhuǎn)錄專家Steve Jackson贊美科恩伯格的全才風(fēng)格,他對《自然》雜志說:“羅杰采用的方法結(jié)合了生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子遺傳學(xué)和功能研究!
  
  十年培育酵母細胞模式
  科學(xué)家們曾經(jīng)相信真核生物與細菌的轉(zhuǎn)錄過程非常類似,然而,經(jīng)驗證明真核生物的轉(zhuǎn)錄過程復(fù)雜得多,第一個RNA――聚合酶就是從哺乳動物的肝臟中提取的,但研究這類分子極為困難。因此,細菌成為第一個用于轉(zhuǎn)錄過程研究的生物。
  1965年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予雅克、莫諾和洛夫,以表彰他們對細菌轉(zhuǎn)錄過程的詳細描述。除RNA-聚合酶外,還有一個名為西格馬因子的分子在細菌轉(zhuǎn)錄過程開始時是必要的,它附著在RNA―聚合酶上,通過識別DNA鏈上的特別密碼來告訴RNA―聚合酶遺傳信息的起點和終點。但科學(xué)家們在真核生物中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的西格馬因子。原來,真核生物中的西格馬因子是5個不同的分子復(fù)合體,它們統(tǒng)稱為普通轉(zhuǎn)錄因子,然而,尋找并提取這5個轉(zhuǎn)錄因子是一件辛苦的工作。
  科恩伯格在這一階段的貢獻是發(fā)展了用于實驗室研究的全新酵母細胞體系。酵母像人類一樣是真核生物,但它比其他真核生物更容易操作,盡管如此,科恩伯格小組用了10年的時間才培育出適合用于轉(zhuǎn)錄過程研究的酵母細胞系統(tǒng),功夫不負(fù)有心人,這個系統(tǒng)讓他得以提取出充足的RNA―聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子,并將它們制作成晶體。
  在這個酵母細胞系統(tǒng)中,科恩伯格還發(fā)現(xiàn)了控制轉(zhuǎn)錄過程開關(guān)的另一種分子復(fù)合體――調(diào)節(jié)器,它指揮特定遺傳密碼的開或閉,從而只轉(zhuǎn)錄特定的信息,如生成肝臟或腎臟的信號。諾貝爾獎公告稱調(diào)節(jié)器的發(fā)現(xiàn)是“認(rèn)識轉(zhuǎn)錄過程的一個真正里程碑”。
  
  物理學(xué)獎回眸宇宙嬰兒時代
  
  2006年10月3日,瑞典皇家科學(xué)院決定將今年的諾貝爾物理學(xué)獎共同授予美國航天局(NASA)戈達德飛行中心的約翰?馬瑟和加州大學(xué)伯克利分校的喬治?斯穆特,以表彰他們“發(fā)現(xiàn)了宇宙微波背景輻射的黑體形式和各向異性”。
  “馬瑟和斯穆特借助美國1989年發(fā)射的COBE(宇宙背景探測)衛(wèi)星作出的發(fā)現(xiàn),為有關(guān)宇宙起源的大爆炸理論提供了支持,將有助于研究早期宇宙,幫助人們更多地了解恒星和星系的起源。他們的工作使宇宙學(xué)進入了‘精確研究’時代!敝Z貝爾獎頒發(fā)的公報如是說。
  宇宙是怎么形成的?
  宇宙是在什么時候以什么方式誕生的?它又如何變得浩瀚無邊呢?
  
  1917年,愛因斯坦將廣義相對論引力場方程應(yīng)用于宇宙的結(jié)構(gòu),在假定宇宙是無限大、均勻的前提下,他發(fā)現(xiàn)方程的解是不穩(wěn)定的,表明宇宙在膨脹或收縮,但他認(rèn)為宇宙應(yīng)該是永恒、穩(wěn)定的,因此給方程加入一個起斥力作用的“宇宙學(xué)常數(shù)”,得到一個靜態(tài)宇宙模型。
  1922年,俄國數(shù)學(xué)家A Friedman證明“宇宙幾乎不可能是靜止的”,并求得不含“宇宙常數(shù)”項的愛因斯坦引力場方程,表明宇宙實際上是無限膨脹的。1927年,根據(jù)愛因斯坦方程和Friedman的結(jié)果,比利時傳教士和天文學(xué)家喬治?勒梅特預(yù)言:過去的宇宙比今天的宇宙占有更小的空間,并且宇宙有一個起始點――“原始原子”。1927年,愛德溫?哈勃觀察到遠方星系的紅移現(xiàn)象,支持了宇宙膨脹的觀點。
  20世紀(jì)40年代,俄國天體物理學(xué)家喬治?蓋莫夫和其博士生拉爾夫?阿爾菲及赫爾曼等提出,宇宙起源于約100億~150億年前一次猛烈的大爆炸,隨著膨脹而溫度降低,構(gòu)成物質(zhì)的元素相繼形成。1949年,他們進一步解釋,大爆炸后的宇宙逐漸冷卻,現(xiàn)在溫度為絕對溫度2.7度(約攝氏零下270度),而且預(yù)言大爆炸留下了“余溫”,宇宙微波背景輻射是大爆炸的“余溫”,它均勻分布在整個宇宙空間中。
  1965年,貝爾實驗室的兩位天文學(xué)家阿農(nóng)?彭齊亞斯和羅伯特?威爾遜發(fā)現(xiàn)了宇宙背景輻射,成為支持宇宙大爆炸留有“余溫”的證據(jù),兩人因此獲得1978年的諾貝爾物理學(xué)獎。
  
  黑體的起源
  根據(jù)大爆炸理論,宇宙形成于一個強烈的熱源,這個熱源釋放出強烈的輻射, 隨著宇宙的成長,輻射以特定的方式按不同波長向外擴散,光譜的形狀取決于釋放時的溫度。但即使不知道釋放時的溫度,也可精確預(yù)測光譜的形狀,科學(xué)家們將這種輻射稱為黑體輻射。
  大爆炸理論預(yù)言,宇宙開始釋放和發(fā)射射線時的溫度約為3000度,隨著宇宙的膨脹,背景輻射漸漸冷卻,但原始的黑體輻射光譜形狀會保留下來。這意味著我們有可能探測到這些上百億年前的輻射,如果能探測到,將是大爆炸理論很好的證明。但探測到這些從遙遠空間和遙遠過去來到地球的微弱輻射信號是極困難的事情。
  人類對宇宙微波背景輻射的第一次測量是在山頂上進行的。馬瑟說:“從地面進行良好的觀察非常困難,因為地球的大氣層會吸收輻射,而且有些波長輻射不能穿越大氣層,大氣層還會釋放自己的輻射,這樣會讓事情非常混淆。所以,到太空中去觀察是很重要的,因為那兒冷清而安靜!倍遥谔罩锌蓪τ钪娴乃蟹较蜻M行探測。
  
  從地面到天空
  1974年,NASA邀請宇航員和宇宙學(xué)家遞交以空間為實驗基地的項目建議書。馬瑟等提出了COBE項目,并領(lǐng)導(dǎo)形成了包括科學(xué)家和工程師等在內(nèi)的1000多人的龐大團體。
  在這個項目中,馬瑟還是衛(wèi)星遠紅外線絕對光度計的負(fù)責(zé)人,這個設(shè)備用于研究背景輻射的黑體光譜形態(tài)。斯穆特是另一決定性設(shè)備的負(fù)責(zé)人,探尋微波背景輻射在不同方向的微小溫差。
  NASA最初打算用航天飛機將COBE送入太空,但1986年“挑戰(zhàn)者”號航天飛機爆炸的悲劇發(fā)生后,美國航天飛機停飛,COBE衛(wèi)星的未來陷入危境。馬瑟和斯穆特與同事們以高超的談判技巧,為項目組專門爭取到一枚火箭,最終于1989年11月18日將COBE送入太空。
  在開始測量9分鐘后,COBE探測到了完美的黑體輻射光譜。1990年1月,當(dāng)馬瑟在一個會議中展示這條曲線時,與會人員起立歡呼。COBE測量到的這條微波背景輻射曲線最終被證明完全符合黑體輻射特征,它的波長對應(yīng)于絕對溫度2.7度(零下270.46攝氏度)的光譜。
  今年10月3日,當(dāng)馬瑟被問及如何與研究團隊?wèi)c祝諾貝爾獎時,他說:“這是一個好問題,我需要和他們商量!
  
  星系的誕生
  但這只是COBE的部分成就。斯穆特負(fù)責(zé)的實驗是尋找微波背景輻射在不同方向的微小溫差。宇宙中微波背景在不同方向的微小溫差可以提供一種新線索,告訴我們星系和恒星是如何出現(xiàn)的。為什么宇宙中的物質(zhì)會集中于一個特定地方而不是像淤泥一樣均勻分布呢?這個小小的溫度就是物質(zhì)的始聚點,一旦這一過程開始,重力開始發(fā)揮作用:物質(zhì)吸引物質(zhì),恒星和星系就形成了。然而,沒有這個開始機制,今天的銀河系、太陽和地球都不會存在。
  當(dāng)COBE項目開始尋找這樣的溫差時,有人預(yù)言這個溫差在千分之一攝氏度,但事實比猜想更艱難:在COBE的建造過程中,有研究人員報告說,受暗物質(zhì)影響,這個溫差在萬分之一攝氏度的范圍內(nèi)。
  尋找如此之小的溫差是一個巨大的挑戰(zhàn)。即使重新設(shè)計COBE的設(shè)備,來自COBE的結(jié)果也非常不確定,而且比想象的更難解釋。因為這個溫差太小而難與不相關(guān)的噪音分開,怎樣才能知道它們是真正的溫差呢?1992年,斯穆特向世界宣布,他發(fā)現(xiàn)了“漣波輻射”:宇宙微波背景輻射溫差為十萬分之幾,這表明宇宙早期存在微波的不均勻性,它導(dǎo)致了物質(zhì)的形成。這是迄今為止大爆炸最強有力的證據(jù)。
  1992年4月29日,英國物理學(xué)家斯蒂芬?霍金在接受《時代》周刊的采訪時說,COBE的結(jié)果“如果不是有史以來最偉大的發(fā)現(xiàn),那么也是20世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)。”
 。10月9日《科學(xué)時報》,標(biāo)題有改動)

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