摘要[目的]探討三生煙葉片及煙花的高質(zhì)量原生質(zhì)體制備方法。[方法]通過(guò)優(yōu)化纖維素酶和離析酶濃度配比、酶解時(shí)間、滲透調(diào)節(jié)劑甘露醇濃度等參數(shù)，研究三生煙葉片與煙花原生質(zhì)體的最優(yōu)制備方法。[結(jié)果]三生煙煙葉材料最佳制備條件為1%纖維素酶和0.5%離析酶、甘露醇濃度0.6 mol/L、酶解時(shí)間4 h，完整率達(dá)88.22%。煙花材料最佳制備條件為0.8%纖維素酶和0.4%離析酶、甘露醇濃度0.7 mol/L、酶解時(shí)間2 h，完整率達(dá)83.59%。 [結(jié)論]三生煙葉片與煙花原生質(zhì)體由于材料來(lái)源不同，酶解條件存在差異，制備時(shí)需要針對(duì)不同組織材料予以?xún)?yōu)化。
　　關(guān)鍵詞 煙葉；煙花；原生質(zhì)體；分離純化；完整率
　　中圖分類(lèi)號(hào)S572文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào)0517-6611（2016）14-011-04
　　植物原生質(zhì)體是由脫去細(xì)胞壁，僅由質(zhì)膜包圍的，具有生活力的裸露細(xì)胞。植物原生質(zhì)體應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，涉及基因表達(dá)調(diào)控與定位、與宿主蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞融合[1-5]，以及克服有性雜交不親和性、花期不育[6-8]等領(lǐng)域的研究。原生質(zhì)體可在細(xì)胞水平上進(jìn)行基因重組，特別是細(xì)胞器，內(nèi)含基因控制的農(nóng)藝性狀改良，如線(xiàn)粒體所控制的細(xì)胞質(zhì)雄性不育等性狀。目標(biāo)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是通過(guò)目標(biāo)基因載體和熒光表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化，在特定種類(lèi)的原生質(zhì)體中得以表達(dá)[9]。在信號(hào)通路研究中，原生質(zhì)體表面膜系統(tǒng)的信號(hào)受體蛋白是信號(hào)受體研究材料[10]，可有效避免細(xì)胞性狀差異導(dǎo)致的研究障礙。原生質(zhì)體由于純度高、細(xì)胞狀態(tài)相近，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可極大程度地解決細(xì)胞蛋白質(zhì)響應(yīng)差異問(wèn)題，提高低豐度蛋白質(zhì)的提取純化效率等問(wèn)題。
　　煙草研究中通常以煙葉為材料，極少涉及其他組織。以煙葉為材料制備原生質(zhì)體對(duì)煙草生長(zhǎng)期要求嚴(yán)格，取材后嚴(yán)重影響煙草幼苗的生長(zhǎng)，而煙花具備花期長(zhǎng)、生物產(chǎn)量相對(duì)較高、生育進(jìn)程容易控制、生理狀態(tài)差異小等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，三生煙也是研究煙草花葉病毒病的重要材料[11]，可以在細(xì)胞水平研究其抗性機(jī)理，因此，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是多領(lǐng)域深入研究的基礎(chǔ)。鑒于此，筆者研究了三生煙葉片及煙花的高質(zhì)量原生質(zhì)體制備方法，旨在為煙草病理研究提供技術(shù)手段。
　　1材料與方法
　　1.1材料
　　1.1.1供試品種。煙草品種三生煙（Nicotiana tabacum L.， cv.Samsun NN）種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。原生質(zhì)體的提取是以三生煙的四葉期葉片和盛花期煙花為試驗(yàn)材料。
　　1.1.2試劑。纖維素酶（Cellulase R-10）、離析酶（Macerozyme R-10）均為日本Yakult原裝進(jìn)口，甘露醇、MES（ 2-N-嗎啉乙烷磺酸）、臺(tái)盼藍(lán)。
　　1.2方法
　　1.2.1材料的培養(yǎng)。
　　將三生煙種子在75%乙醇中浸泡30 s，在 10%雙氧水中消毒 10 min，用無(wú)菌水沖洗2～3次。搓揉去除種子的表面蠟質(zhì)成分，培養(yǎng)皿中25 ℃催芽2～3 d，移植至9孔板培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基質(zhì)中，每個(gè)小孔放置2～3顆已發(fā)芽種子，十字期移栽進(jìn)入花盆。培養(yǎng)箱中晝夜溫度分別為28和20 ℃，培養(yǎng)至四葉期，取用幼嫩葉片制備原生質(zhì)體，進(jìn)入花期后以煙花為材料制備原生質(zhì)體。
　　1.2.2原生質(zhì)體的分離。
　　煙葉取材四葉期葉片，煙花為盛開(kāi)期[12]（開(kāi)花3 d，花冠開(kāi)裂成平面）煙花。在超凈工作臺(tái)上將取植物材料剪碎為1 mm×1 mm碎片，置于10 mL 酶解液中，酶解液為CPW鹽溶液 （KH2PO4 27.200 mg/L、KNO3 101.000 mg/L、CaCl2·2H2O 1 480.000 mg/L、MgSO4·7H2O 246.000 mg/L、KI 0.160 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L），包含Cellulase R-10、Macerozyme R-10、滲透調(diào)節(jié)劑甘露醇0.6 mol/L、質(zhì)膜穩(wěn)定劑MES 濃度為5 mmol/L[13]，pH 5.8。材料碎片與酶解液充分接觸混勻，真空泵抽氣30 min，封口后置于26 ℃氣浴恒溫振蕩器內(nèi)40 r/min回旋振蕩，避光酶解。
　　1.2.3酶濃度及酶解時(shí)間的優(yōu)化。
　　前期研究顯示纖維素酶和離析酶的最適質(zhì)量比為2∶1[14]，由于幼嫩葉片和煙花的纖維素含量較低，所以設(shè)置葉片的酶濃度梯度為1.50%/0.75%、1.00%/0.50%、0.50%/0.25%，煙花的酶濃度梯度分別為1.60%/0.80%、1.20%/0.60%、0.80%/0.40%，酶解體系均為10 mL。
　　電子顯微鏡下觀(guān)察原生質(zhì)體酶解情況。酶解煙葉每2 h觀(guān)察一次酶解效果，設(shè)置時(shí)間2、4、6和8 h；酶解煙花每1 h觀(guān)察一次酶解效果，設(shè)置時(shí)間1、2、3和4 h。
　　1.2.4滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇的濃度優(yōu)化。
　　2種材料在最佳酶濃度及酶解基礎(chǔ)上，設(shè)置甘露醇濃度梯度為0.5、0.6、0.7和0.8 mol/L。原生質(zhì)體洗滌液中使用含有同濃度的甘露醇洗滌溶液，純化后觀(guān)察記錄原生質(zhì)體的產(chǎn)率和完整率。
　　1.2.5原生質(zhì)體的純化。
　　2種原生質(zhì)體均用 300 目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液經(jīng) 700 r/min離心 5 min，去掉上清液，加 CPW洗滌液5 mL，700 r/min離心 5 min，洗去酶液，棄上清液，預(yù)留2 mL 原生質(zhì)體懸液緩慢覆蓋在 5 mL 20%蔗糖溶液上表面，500 r/min離心 5 min，吸取中間層原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入干凈離心管，用洗滌緩沖液輕輕洗滌2次，用刻度離心管稀釋到1 mL。
　　用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)純化后細(xì)胞膜完整的原生質(zhì)體數(shù)量，計(jì)算同一計(jì)數(shù)板上、下2個(gè)計(jì)數(shù)室所測(cè)定的原生質(zhì)體平均值。
　　利用臺(tái)盼藍(lán)染色可將死細(xì)胞染成藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染的性質(zhì)，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行活體染色。原生質(zhì)體完整率=未染成藍(lán)色的完整原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù) ×100%。3 次重復(fù)取平均值，每次重復(fù)統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野。

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