[摘要] 采用高效液相色譜法建立了金鐵鎖藥材中尿囊素的含量測定方法。金鐵鎖藥材經(jīng)乙醇提取后，取續(xù)濾液進(jìn)行分析。采用ZORBAX NH₂色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），檢測波長220 nm，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水（93∶7），流速1.0 mL·min^-1。結(jié)果表明，尿囊素線性關(guān)系良好，具有較好的精密度和重復(fù)性。在0.010 4 ～ 0.166 g·L^-1，尿囊素的線性相關(guān)系數(shù)R²=0.999 4（n=5）；RSD（n=6）小于2.1%；平均回收率為95.47%～ 100.9%。該方法具有良好的靈敏度、回收率和重復(fù)性，可為金鐵鎖藥材的質(zhì)量控制提供參考。
　　[關(guān)鍵詞] 金鐵鎖；入血活性成分；尿囊素；高效液相色譜
　　中藥是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)體系，它對人體的作用通常也被認(rèn)為是多成分和多靶點(diǎn)綜合效應(yīng)的結(jié)果，因此中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與西藥有著跟本的區(qū)別。目前，從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的角度來制定中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法主要有色譜法、光譜法以及質(zhì)譜法等。然而不管選取哪種方法作為中藥材的質(zhì)量控制方法，都必須先選擇好合適的對照品。通常對照品的選擇大部分都是藥材中含量相對較大的特征化合物或者是有效成分。前者雖然是中藥材中所含有的主要化合物，但是并不一定是中藥材發(fā)揮藥效作用的化合物，因此選擇這樣的化合物作為指標(biāo)性化合物制定的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能從根本上控制中藥材的質(zhì)量。后者是中藥材中具有一定生物活性的化合物，用它來制定中藥村的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定的理論意義和實(shí)踐意義。傳統(tǒng)中藥多為口服給藥，其有效物質(zhì)必須以血液為介質(zhì)輸送到靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生作用，因而給藥后的血清才是真正起作用的“制劑”，血清中含有的成分才是中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，入血后的活性成分才是真正的有效成分^[1-2]。
　　金鐵鎖Psammosilene tunicoides為石竹科金鐵鎖屬植物的干燥根，主要分布在貴州、云南、四川、西藏等中國西南地區(qū)，是我國西南地區(qū)特有的單屬種植物，也是貴州民間常用藥物，現(xiàn)已作為稀有瀕危物種列于《中國植物紅皮書》中，屬國家二級保護(hù)植物。金鐵鎖以根入藥，具有散瘀定痛、止血、消癰排膿之功，用于跌打損傷、風(fēng)濕痛、胃氣痛、創(chuàng)傷出血等的治療^[3-5]。
　　金鐵鎖被收錄于《中國藥典》2010年版中，但在該標(biāo)準(zhǔn)中沒有用其化學(xué)成分為指標(biāo)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)。本研究以金鐵鎖中的入血化學(xué)成分（尿囊素）為指標(biāo)，建立了金鐵鎖藥材中尿囊素HPLC含量測定方法，該方法的精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，回收率高，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可為控制金鐵鎖藥材的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為以化學(xué)成分為指標(biāo)的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。
　　1 材料
　　高效液相色譜儀Ultimate300高效液相色譜儀（包括四元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器，柱溫箱），1/10萬電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），KQ5200E型超聲波清洗（昆明市超聲儀器有限公司）。
　　色譜乙腈；水（重蒸水，臨用前制備）；無水乙醇；尿囊素對照品（中國食品藥品檢定研究院，1501-200001）；金鐵鎖藥材經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為金鐵鎖P. tunicoides（6個(gè)不同產(chǎn)地）。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 樣品前處理
　　2.1.1 血漿樣品前處理 取干燥、粉碎后的金鐵鎖藥材2.0 g，用30 mL 20%乙醇進(jìn)行超聲提取2次，合并提取液，減壓濃縮回收溶劑后得金鐵鎖提取物。取適量金鐵鎖提取物用水溶解，配成濃度為20 g·L^-1的溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠（210 g）金鐵鎖提取物水溶液3 mL，分別在10，30，60，120 min后對大鼠進(jìn)行采血，將血液離心后取上層血漿100 μL用乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻后離心，將上層清液于氮吹儀上吹干，取93%乙腈100 μL進(jìn)行溶解，離心后待測。空白血漿按同樣方法處理。
　　2.1.2 藥材前處理 取金鐵鎖藥材2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶或三角瓶中，加入20%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，補(bǔ)重后取續(xù)濾液進(jìn)行測定。
　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
　　精密稱取適量尿囊素對照品1.66 mg，加20%乙醇制成每1 mL含0.166 mg的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，根據(jù)需要用20%乙醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，即用即配。
　　2.3 高效液相色譜條件
　　ZORBAX NH₂色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（93∶7）；流速1.0 mL·min^-1；檢測波長220 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。
　　2.4 入血實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　將處理好的血漿樣品經(jīng)高效液相色譜儀測定，通過尿囊素對照品及空白血漿樣品的高效液相色譜圖的比較，確定尿囊素為金鐵鎖藥材中的1個(gè)入血化學(xué)成分，其結(jié)果見圖1。
　　2.5 提取條件的選擇
　　分別采用回流和超聲2種提取方式進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取效果較好。對不同濃度的乙醇以及溶劑用量、提取時(shí)間和次數(shù)進(jìn)行了考查，最終確定提取條件為30 mL 20%乙醇超聲提取40 min。
　　2.6 檢測波長的選擇
　　根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]以及多次實(shí)驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)檢測波長為220 nm時(shí)效果較好。
　　2.7 柱溫的選擇
　　考察了不同柱溫對尿囊素分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫為40 ℃時(shí)，峰形較好，分離度較好。
　　2.8 線性關(guān)系的考察
　　精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的尿囊素1.66 mg于10 mL量瓶中，加20%乙醇配成0.166 g·L^-1的對照品儲備液。分別制備得0.010 4，0.020 8，0.041 5，0.083，0.166 g·L^-1 5個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，分別精密吸取該對照品系列溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，并以對照品的峰面積（X）為橫坐標(biāo)，濃度（g·L^-1）Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=0.013 7X+0.001 2，R²=0.999 4（n=5），結(jié)果表明，尿囊素在0.104～1.66 mg線性關(guān)系良好。

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