目錄

　第一篇

　細(xì)菌室操作程序文件

　 1. 細(xì)菌室人員崗位職責(zé)……………………………………………………..1 2. 標(biāo)本采集及保存要求………………………………………………………3 3. 顯微鏡檢查法操作規(guī)程……………………………………………………5 4. 細(xì)菌室標(biāo)本操作流程………………………………………………………6 5. 細(xì)菌的形態(tài)檢查操作規(guī)程…………………………………………………8 6. 細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程………………………………11 7. 細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程………………………………………17 8. 支原體培養(yǎng)、鑒定及藥敏操作規(guī)程……………………………19 9. 血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程…………………………………………20 10. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程………………………………22 11. 下呼吸道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程……………………………………24 12. 尿路感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程…………………………………………26 13. 消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程………………………………………29 14. 膿汁及病灶分泌物細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)程………………………………31 15. 生殖系統(tǒng)標(biāo)本的處理……………………………………………………33 16. 抗菌藥物敏感試驗(yàn)………………………………………………………34

　第二篇

　醫(yī)院微生物感染控制檢測(cè)

　17. 消毒滅菌效果監(jiān)測(cè)……………………………………………………….37 18. 環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)………………………………………………………….38 19. 采樣及檢查原則…………………….………….………………………..39 20. 各部位的消毒…………………………………………………………….43

　細(xì)菌室人員崗位職責(zé)

　 1、上班后先搞好室內(nèi)衛(wèi)生、核查各個(gè)培養(yǎng)箱、冰箱的工作溫度是否在設(shè)定的范圍內(nèi)，并做好記錄。檢查各種儀器工作是否正常，做好記錄。

　2、接收樣本：核對(duì)各樣本號(hào)與申請(qǐng)單聯(lián)號(hào)是否一致，如不一致馬上與病房聯(lián)系以便作出相應(yīng)的處理，如退單或重送樣本等，并做好聯(lián)系情況的記錄。核查各送檢樣本是否符合要求。

�、� 痰液樣本：先看外觀、再直接涂片鏡檢，以白細(xì)胞≥25 個(gè)/低倍鏡視野，而上皮細(xì)胞≤10 個(gè)/低倍鏡視野，為合格痰液。

�、� 無(wú)菌體液樣本：檢查各種無(wú)菌體液樣本的盛放器皿是否符合要求。

　③ 容易干燥的樣本：對(duì)一些容易干燥的樣本如大便、咽拭子、膿液拭子、泌尿生殖道拭子等是否已經(jīng)干燥。

　對(duì)不符合要求的樣本必需與臨床聯(lián)系，以便作出相應(yīng)處理，方法如聯(lián)號(hào)不符的樣本，做好記錄。對(duì)符合的樣本進(jìn)行原始單的登記。

　3、樣本編號(hào)：對(duì)符合的樣本作出編號(hào)，普通細(xì)菌培養(yǎng)：痰液、咽拭子、血液增菌培養(yǎng)、尿液、胸、腹水、腦脊液、膽汁、膿液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培養(yǎng)。在各種培養(yǎng)基上及申請(qǐng)單上編號(hào)的同時(shí)均需明確標(biāo)明接種日期。

　4、樣本接種：

�、� 血液、骨髓、腹水、關(guān)節(jié)液等：增菌培養(yǎng)瓶； ② 痰液、咽拭子：血平板、麥康凱平板； ③ 尿液：血平板、麥康凱平板； ④ 大便致病菌：SS 平板； ⑤ 腦脊液：血平板、巧克力平板； ⑥ 分泌物的淋球菌培養(yǎng)接種：淋球菌專用平板； ⑦ 支原體培養(yǎng)+藥敏：按說(shuō)明書接種支原體專用培養(yǎng)基。

　對(duì)以上接種樣本的當(dāng)前編號(hào)應(yīng)記錄于登記本上。此外對(duì)痰、膿液、腦脊液等在接種的同時(shí)應(yīng)對(duì)其沉渣進(jìn)行革蘭染色，如有細(xì)菌和或何種細(xì)菌為主立刻通知臨床，并做好記錄。

　5、查對(duì)昨天移種平板申請(qǐng)單及原始登記本，確定標(biāo)本移種是否正確。觀察

　血液增菌培養(yǎng)瓶，如發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，馬上涂片革蘭染色，將細(xì)菌的染色特性及形態(tài)報(bào)告給臨床，并做好記錄，同時(shí)進(jìn)行移種。

　6、觀察平板，挑取可疑菌落涂片革蘭染色，并做好細(xì)菌的鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn)工作。

　7、檢查各種培養(yǎng)基及試劑的庫(kù)存量，做好需配制培養(yǎng)基或購(gòu)買試劑的交班工作。

　8、定期做好本室所用鑒定和藥敏試條的質(zhì)控，做好記錄。

　9、每天必須消毒平板、基礎(chǔ)培養(yǎng)基等用于常規(guī)醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)，另外根據(jù)具體情況即時(shí)準(zhǔn)備好各種中和劑、無(wú)菌瓶等，對(duì) 48 小時(shí)的空氣培養(yǎng)出報(bào)告，同時(shí)注意是否有致病菌、菌落數(shù)是否超標(biāo)。

　10、工作完成后注意對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒、室內(nèi)進(jìn)行消毒。

　標(biāo)本采集及保存要求

　1、總則：用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本在收集時(shí)應(yīng)注意嚴(yán)格無(wú)菌操作和及時(shí)送檢，檢測(cè)后標(biāo)本應(yīng)妥善保存。

　2、臨床標(biāo)本的采集 2.1、下呼吸道分泌物(痰液) 令患者早上起床后用清水瀨口，不要刷牙，立即從下部呼吸道咳出第一口痰，吐在無(wú)菌塑料痰盒中，及時(shí)送檢。

　2.2、尿液(中段尿) 護(hù)理人員協(xié)助采取中段尿約 3ml 入無(wú)菌塑料盒中，及時(shí)送檢。

　2.3、糞便 取有粘液、膿血部分的糞便置無(wú)菌塑料盒中及時(shí)送檢。

　2.4、眼、耳、鼻、喉拭子 將棉拭子沾取少許無(wú)菌生理鹽水(如沾取的太多，可在無(wú)菌生理鹽水瓶壁上擠去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒懸于無(wú)菌塑料盒中，及時(shí)送檢。

　2.5、膿液 用沾有生理鹽水的棉拭子沾取膿液，要盡量多取一些，然后將棉拭置于無(wú)菌塑料盒中，及時(shí)送檢。

　2.6、血液 2.6.1、凡懷疑菌血癥和敗血病的患者，采血培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，應(yīng)盡量選擇抗菌素在體內(nèi)濃度最低時(shí)采血，應(yīng)在病人第二次使用抗菌素之前采集血培養(yǎng)標(biāo)本。當(dāng)然在病人發(fā)熱或寒顫時(shí)采集也可。

　2.6.2、成人每次采血 5～10m1，小兒采血 3～5ml。

　2.6.3、嚴(yán)格消毒病人采血部位和血培養(yǎng)瓶口，抽一定量血液后，無(wú)菌注入血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，輕輕搖勻。

　2.6.4、從抽血到接種入瓶，動(dòng)作要快，防止血液凝固，同時(shí)要及時(shí)送檢。

　2.7、穿刺液

　胸腹水、心包液、關(guān)節(jié)腔液、鞘膜積液，嚴(yán)格無(wú)菌抽取后，注入含肝素抗凝的無(wú)菌試管中，輕輕顛倒試管 10 余次，使肝素與穿刺液混勻達(dá)到抗凝的目的，或直接無(wú)菌注入血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)及時(shí)送檢。

　2.8、膽汁 由�？漆t(yī)生以無(wú)菌方法取引流液 10m1 注入無(wú)菌塑料盒內(nèi)。

　2.9、腦脊液 以無(wú)菌方法取腦脊液 3～5ml，置無(wú)菌試管內(nèi)，常溫保存送檢，如只做培養(yǎng)可直接無(wú)菌注入血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，及時(shí)送檢。

　2.10、生殖器官標(biāo)本 陰道、子宮頸及前列腺等分泌物應(yīng)由醫(yī)師采集，收集于無(wú)菌塑料盒內(nèi)送檢。

　如疑為淋病奈瑟菌感染，做培養(yǎng)檢查時(shí)，采集的標(biāo)本應(yīng)床旁接種并及時(shí)放入孵箱培養(yǎng)。

　2.11、燒傷標(biāo)本 以無(wú)菌棉拭子直接采取多個(gè)部位創(chuàng)面的膿汁分泌物放入無(wú)菌塑料盒中。

　2.12、支原體（解脲、人型）培養(yǎng)+藥敏的標(biāo)本采集 2.12.1、支原體對(duì)干、熱抵抗力差，標(biāo)本采集后應(yīng)盡快接種支原體運(yùn)送培養(yǎng)基送檢。

　2.12.2、男性：用細(xì)的無(wú)菌棉拭子沾取無(wú)菌鹽水少許深入尿道口內(nèi)2～2.5cm。

　3、臨床標(biāo)本的保存 細(xì)菌室標(biāo)本原則上要求及時(shí)送檢、及時(shí)處理，不得保存。

　顯微鏡檢查法操作規(guī)程

　顯微鏡檢查是細(xì)菌鑒定工作中的一重要手段，有助于細(xì)菌的初步鑒別，同時(shí)對(duì)下一步鑒定工作起著重要的指導(dǎo)作用。有時(shí)通過(guò)形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，如痰中的抗酸桿菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。顯微鏡檢查有不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法兩種。

　1、不染色標(biāo)本的檢查：不染色標(biāo)本主要用于檢查細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況。

　1.1、壓滴法：用接種環(huán)取細(xì)菌懸液 2 環(huán)，置于清潔載玻片中央，覆上蓋玻片，于高倍鏡下觀察。制片時(shí)菌液要適量，不可有氣泡，不可外溢。

　1.2、懸滴法：取潔凈的凹窩載玻片及蓋玻片各 1 塊，將凹孔四周的平面上涂上一層凡士林，取一環(huán)菌液置蓋玻片中央，將凹窩載玻片的凹面向下，對(duì)準(zhǔn)于蓋玻片的液滴上，然后迅速翻轉(zhuǎn)玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片使之與凹孔邊緣粘緊。鏡下觀察時(shí)先低倍后高倍，不可壓碎蓋玻片。有動(dòng)力的細(xì)菌可見(jiàn)細(xì)菌從一處移到另一處，無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動(dòng)而無(wú)位置的改變。螺旋體由于菌體纖細(xì)、透明，需用暗視野顯微鏡觀察其形態(tài)、活動(dòng)。

　2、染色標(biāo)本檢查法：通過(guò)對(duì)標(biāo)本的制片及染色，能觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性以及莢膜、芽胞、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步鑒定。

　2.1、快速革蘭染色法 2.1.1、操作見(jiàn)試劑說(shuō)明書 2.1.2、結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

　2.1.3、注意事項(xiàng)：染色關(guān)健在于涂片和脫色，涂片不宜過(guò)厚，固定不宜過(guò)熱，脫色不宜過(guò)度，菌齡為 18～24 小時(shí)為佳。

　2.2、抗酸染色法 2.2.1、操作見(jiàn)試劑說(shuō)明書 2.2.2、結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色。

　2.2.3、注意事項(xiàng)：每一張玻片只能涂一份標(biāo)本且不能在染色缸中染色，以免造成不同標(biāo)本間的交互污染從而導(dǎo)致陰陽(yáng)性結(jié)果混淆，至無(wú)紅色液體流下。

　3、墨汁負(fù)染鏡檢：背景著色而菌體不著色的染色法，用以觀察新型隱球菌的寬厚莢膜等。

　菌室標(biāo)本操作流程

　1、標(biāo)本的接受 1.1、標(biāo)本接受的時(shí)間：原則上全天任何時(shí)間均可。

　1.2、標(biāo)本的接受：接受標(biāo)本者要認(rèn)真核對(duì)標(biāo)本的數(shù)量、標(biāo)本與檢驗(yàn)單要求是否相符以及標(biāo)本的質(zhì)量等。

　1.3、把接受的標(biāo)本編號(hào)。

　2、臨床標(biāo)本的接種 2.1、檢驗(yàn)?zāi)康氖羌?xì)菌培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)。各臨床標(biāo)本的培養(yǎng)基選擇如下：

　2.1.1 培養(yǎng)基的選擇 標(biāo)本類型 培養(yǎng)基 血 中段尿 腦脊液 穿刺液 膽汁 呼吸道標(biāo)本 糞便標(biāo)本 病灶分泌物 血培養(yǎng)瓶 血平板、麥康凱平板 血平板、巧克力平板 血平板、麥康凱平板 血平板、麥康凱平板 血平板、麥康凱平板 SS 平板 血平板、麥康凱平板 2.1.2、生殖器標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗(yàn)項(xiàng)目接種相應(yīng)的平板，操作如下：淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板；念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通細(xì)菌培養(yǎng)，則接種血平板和巧克力平板；衣原體抗原檢測(cè)的按《衣原體抗原檢測(cè)的操作規(guī)程》進(jìn)行檢驗(yàn)。

　2.2、接種的方法：標(biāo)本做分區(qū)劃線。

　2.3、檢驗(yàn)?zāi)康臑檎铱顾釛U菌的按《找抗酸桿菌的操作規(guī)程》進(jìn)行檢驗(yàn)。

　3、所接種的平板必須寫上標(biāo)本的編號(hào)和接種的日期，然后根據(jù)要求進(jìn)行培養(yǎng)。

　4、標(biāo)本的培養(yǎng)條件、溫度、時(shí)間 平板 培養(yǎng)條件、溫度、時(shí)間 血平板 巧克力平板 淋球菌平板 沙保羅平板 其他的平板 孵箱、35—37℃、18—24 小時(shí) 孵箱、35—37℃、18—24 小時(shí) 孵箱、35—37℃、18—24 小時(shí) 孵箱、28—31℃、24—36 小時(shí) 孵箱、35—37℃、18—24 小時(shí) 5、根據(jù)生長(zhǎng)在平板上的細(xì)菌菌落形態(tài)、菌落涂片、染色、鏡檢等來(lái)綜合判斷細(xì)菌形態(tài)和染色性質(zhì)，按各屬鑒定的作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行各菌屬的常規(guī)鑒定及藥敏試驗(yàn)。

　6、結(jié)果的報(bào)告 確認(rèn)細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果后，進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)單結(jié)果報(bào)告的存盤、打印。

　7、對(duì)各類細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求進(jìn)行無(wú)害化處理。

　細(xì)菌的形態(tài)檢查操作規(guī)程

　1、不染色標(biāo)本的檢查 壓滴法和懸滴法。主要用于檢查生活狀態(tài)下的細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況。將特制好的標(biāo)本置于顯微鏡載物臺(tái)中央，先以低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。

　結(jié)果：有鞭毛的細(xì)菌呈穿梭似流星狀運(yùn)動(dòng)(有明顯的方向性)；無(wú)鞭毛的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動(dòng)(只在原地顫動(dòng)而無(wú)位置的改變)。

　2、細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查 染色的第一步是制作涂片。菌落涂片時(shí)，先取生理鹽水 l 滴，置玻片上，用接種針挑取菌落，在鹽水中涂布。涂片時(shí)必須注意應(yīng)輕輕操作。猛烈的動(dòng)作會(huì)改變菌細(xì)胞原有的排列形式，或造成細(xì)菌鞭毛脫落，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。制備的涂片應(yīng)自然干燥，并經(jīng)火焰固定，固定溫度不宜過(guò)高，以玻片背面接觸手背不燙為準(zhǔn)，否則可能使細(xì)胞形態(tài)改變。將固定后的涂片進(jìn)行染色。

　2.1、革蘭染色 本染色是最基本的染色法，可用于標(biāo)本涂片或菌落涂片。染色結(jié)果將細(xì)菌分為革蘭陽(yáng)性(紫色)和革蘭陰性(紅色)兩類。

　2.1.1、試劑 (1) 結(jié)晶紫溶液

　 A 液：

　 結(jié)晶紫

　 2g

　95％乙醇

　 20ml

　 B 液：

　 草酸銨

　 0.8g

　蒸餾水

　 80ml 需在用前 24h 將 A 液、B 液混合，過(guò)濾后裝入試劑瓶?jī)?nèi)備用。

　(2) 碘液

　 碘

　 lg

　 碘化鉀

　 2g

　 蒸餾水

　 300ml 碘與碘化鉀混合并研磨，加入幾毫升水，使其逐漸溶解，然后研磨，繼續(xù)加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補(bǔ)足水量。

　也可用少量蒸餾水，先將碘化鉀完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至 300ml。

　(3) 脫色液：95％乙醇。

　(4) 復(fù)染液

　 A．

　貯存液：沙黃

　 2.5g

　95%乙醇

　100ml

　B．

　應(yīng)用液：

　A 液

　 10ml

　蒸餾水

　90ml 染色方法：

　(1)．涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫液染 1 min，清水沖去染液。

　(2)．加碘液染 1 min，水洗。

　(3)．加脫色液，不時(shí)搖動(dòng)約 10～30s，至無(wú)紫色脫落為止，水洗。

　(4)．加復(fù)染液，染 30s，水洗。

　(5)．干后鏡檢。

　2.2、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰標(biāo)本時(shí)，可以適當(dāng)增加標(biāo)本涂片的厚度，以提高檢出率。染厚涂片時(shí)，須掌握復(fù)染色時(shí)間。如果背景過(guò)深，影響鏡檢。

　奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性，取培養(yǎng)菌落涂片染色時(shí)，呈現(xiàn)兩種現(xiàn)象，視野中有些菌陽(yáng)性，另外一些則陰性；有時(shí)同一個(gè)菌體上，紅色的深淺亦有不同，觀察時(shí)應(yīng)予注意。

　試

　劑

　(1)、石炭酸復(fù)紅溶液

　 堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液

　 10ml

　 5％石炭酸溶液

　90ml

　(2)、脫色劑

　濃鹽酸

　 3ml

　95%乙醇

　 97ml

　(3)、復(fù)染液(呂弗勒美藍(lán)液)

　 美藍(lán)乙醇飽和溶液

　30ml

　10％氫氧化鉀

　0.1m1

　 蒸餾水

　100ml 染色方法 (1)、涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰，持續(xù)約 5 min（若染色奴卡菌需要加長(zhǎng)時(shí)間），水洗。

　(2)、加脫色劑，不時(shí)搖動(dòng)玻片至無(wú)紅色脫落為止，水洗。

　(3)、加復(fù)染液，染 0.5～l min，水洗。

　(4)、干后鏡檢。分枝桿菌呈紅色，背景為藍(lán)色。

　注：奴卡菌、放線菌標(biāo)本染色時(shí)，脫色劑改用 2％硫酸水溶液。

　2.3、墨汁莢膜染色 用于觀察菌體有無(wú)莢膜結(jié)構(gòu)，借此鑒定某些菌，如新型隱球菌。

　傳統(tǒng)的方法是用印度墨汁，但目前國(guó)內(nèi)無(wú)售。常規(guī)工作可以用墨汁或墨水代替，但應(yīng)注意顆粒不能太粗，否則影響觀察結(jié)果。有人用 5％黑色素水溶液做染料，效果較好。

　試 劑 印度墨汁或 5％黑色素水溶液。

　染色方法 將標(biāo)本與 1 滴染色液在載玻片上混合，加上蓋玻片，輕輕壓一下，使標(biāo)本混合液變薄。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞。找到后，轉(zhuǎn)換高倍鏡確認(rèn)。

　細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它試驗(yàn)操作規(guī)程

　1、氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(O-F 試驗(yàn)) 原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型�？梢赃M(jìn)行無(wú)氧降解的，稱為發(fā)酵型(發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無(wú)氧的條件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。

　方法：將待檢細(xì)菌同時(shí)穿刺接種兩支 Hugh-Leifson 培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無(wú)菌石蠟(或其它礦物油)，高度不少于 lcm。35℃，24 小時(shí)或更長(zhǎng)。

　結(jié)果：培養(yǎng)基變黃表示細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，兩支培養(yǎng)基均無(wú)變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型；兩支培養(yǎng)基均均產(chǎn)酸為發(fā)酵型。若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵細(xì)菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者均為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌問(wèn)的鑒別。

　2、β-半乳糖苷酶(ONPG)試驗(yàn) 原理：細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚β-D-半乳糖苷(無(wú)色)生成鄰-硝基酚(黃色)。

　結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性反應(yīng)，一般在 20-30 分鐘內(nèi)顯色。

　應(yīng)用：主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。

　3、七葉苷水解試驗(yàn) 原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成黑色的化合物。

　結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于 D 群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別。前者為陽(yáng)性，后者為陰性。也可用于革蘭陰性菌與厭氧菌的鑒別。

　4．甲基紅試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基 pH 值降至 4.5 以下，加入甲基紅呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。若細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物，則培養(yǎng)基 pH 值仍在 6.2 以上，加入甲基紅呈現(xiàn)黃色為陰性。

　結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，橘紅色為弱陽(yáng)性。黃色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌，前者陽(yáng)性，后者陰性。此外腸桿菌科中變形桿菌屬、沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬和志賀菌屬等陽(yáng)性，而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。

　5、VP 試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，氧化為二乙酰，與精氨酸中的胍基作用生成紅色化合物。

　結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，如無(wú)紅色出現(xiàn)且于 35℃4h 后仍如故者即為陰性。

　應(yīng)用：本試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧?yáng)性的細(xì)菌，后者通常為陰性。

　6、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn) 原理：細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚(靛基質(zhì))，加入對(duì)位二甲基苯甲醛生成紅色玫瑰吲哚。

　結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定。

　6、尿素分解試驗(yàn) 原理：具有尿素酶(尿酶)的細(xì)菌，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，培養(yǎng)基變堿。

　結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定，奇異變形桿菌、普通變形桿菌為陽(yáng)性，克雷伯菌屬、枸椽酸菌屬、雷氏普羅威登菌和摩根摩根菌為陽(yáng)性。

　7、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨生成苯丙酮酸，加入 FeCl 3 生成綠色化合物。

　結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽(yáng)性，應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長(zhǎng)會(huì)引起退色。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定，變形桿菌屬、普羅威登斯菌和摩根摩根菌均為陽(yáng)性。腸桿菌科其它菌均為陰性。

　8、氨基酸脫羧酶試驗(yàn) 原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，分解氨基酸脫羧生成胺和 CO 2 使培養(yǎng)基變堿，指示劑改變顏色。

　結(jié)果：對(duì)照管應(yīng)呈黃色，測(cè)定管呈紫色(指示劑為溴甲酚紫)為陽(yáng)性。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。

　9、氧化酶試驗(yàn) 原理：氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素 C 氧化，再由氧化型細(xì)胞色素 C 使對(duì)苯二氨氧化。生成有色醌類化合物。

　結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸 10 秒內(nèi)呈紫色為陽(yáng)性。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)作陰、陽(yáng)性對(duì)照。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別，前者為陰性。后者為陽(yáng)性。

　10、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn)) 原理：具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。

　試劑：3％過(guò)氧化氫溶液 方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加 3％過(guò)氧化氫數(shù)滴；或直接滴加 3％過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)基中，立即觀察結(jié)果。

　結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡為陰性。

　應(yīng)用：革蘭陽(yáng)性球菌中，葡萄球菌和微球菌均陽(yáng)性。而鏈球菌均陰性。

　1l、硝酸鹽還原試驗(yàn) 原理：包括兩個(gè)過(guò)程：一是在合成過(guò)程中，硝酸鹽還原為亞哨酸鹽和氨。再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)菌內(nèi)其它含氮化合物。二是在分解代謝過(guò)程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的受氫體，能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從哨酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其它還原性產(chǎn)物。

　結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。若加入試劑后無(wú)顏色變化反應(yīng)，可能是①硝酸鹽沒(méi)有被還原，試驗(yàn)陰性。②硝酸鹽被還原為氨和氮等其它產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性，這時(shí)應(yīng)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表明為試驗(yàn)為假陰性。

　應(yīng)用：本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用廣泛。

　12、氧化酶(改良法)試驗(yàn) 試劑：

　四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)

　 6.0g 二甲基亞砜(DMSO)

　 100.oml 溶解 TMPD 于 DMSO 中，置于避光玻塞瓶中，可在室溫中保留幾個(gè)星期。

　方法：被檢菌株移種于 7％羊血瓊脂上，30℃需氧條件下孵育 15～18h，刮取菌落涂布于無(wú)色濾紙片上，加 l 滴上述試劑，陽(yáng)性者在 2min 內(nèi)呈深藍(lán)色。

　若被測(cè)菌株移種在蛋白胨酵母浸出液瓊脂上，至少孵育 3 天以上，才可檢測(cè)，陽(yáng)性反應(yīng) 5～10min 出現(xiàn)。

　13、CAMP 試驗(yàn) 原理：B 群鏈球菌能產(chǎn)生 CAMP 因子，可促進(jìn)葡萄球菌的β-溶血素溶解紅細(xì)胞活性，因此在兩菌的交界處溶血力增加。出現(xiàn)矢形(半月形)的溶血區(qū)。

　結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)為陽(yáng)性 應(yīng)用：在鏈球菌中，只有 B 群鏈球菌 CAMP 試驗(yàn)陽(yáng)性。

　14、O/129 抑菌試驗(yàn) 原理：O/129(二氨基喋啶)對(duì)弧菌屬、鄰單胞菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對(duì)氣單胞菌無(wú)抑制作用。

　方法：將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上，鑷取 O/129 紙片(含藥 40ug)貼于平板上，35℃，18~24h，觀察結(jié)果。

　結(jié)果：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，無(wú)抑菌環(huán)為耐藥 應(yīng)用：弧菌屬、鄰單胞菌屬對(duì) O／129 敏感，而氣單胞菌屬耐藥 15、桿菌肽試驗(yàn) 原理：A 群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全部敏感，而其它鏈球菌絕大多數(shù)對(duì)其耐藥。

　16、奧普托欣試驗(yàn) 原理：幾乎所有的肺炎鏈球菌對(duì) Optochin 敏感，而 Optochin 對(duì)其它鏈球菌則無(wú)抑制作用 17、．H 2 S 試驗(yàn)

　原理：有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到鉛或亞鐵離子，則生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。

　結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科屬或種的鑒定。

　18、觸酶試驗(yàn)(過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)) 試劑：3%H 2 0 2 溶液，置棕色瓶?jī)?nèi)于 4℃陰暗處保存。

　方法：先挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的玻片上，然后滴加 3％過(guò)氧化氫溶液 1～2 滴。靜置之，lmin 內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡的為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性。

　19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子試驗(yàn) 葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝固酶試驗(yàn)稱為葡萄球菌凝固酶，玻片法為檢測(cè)凝聚因子。

　19.1 凝聚因子試驗(yàn)：取 1 滴蒸餾水于潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于蒸餾水中，制成濃的菌懸液，無(wú)自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)家兔血漿混合，10s 內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)明顯細(xì)菌凝塊為陽(yáng)性，否則為陰性。如超過(guò) 10s 可出現(xiàn)假陽(yáng)性，有 10％～15％金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必須用試管法驗(yàn)證凝聚因子試驗(yàn)。

　操作過(guò)程中的注意點(diǎn)：

　(1)10s 內(nèi)觀察結(jié)果。

　(2)必須制備濃厚的均勻菌懸液。

　(3)用 EDTA 抗凝的兔血漿為最好。

　(4)加血漿后不要再混攪，以免細(xì)菌凝塊分散變小。

　(5)生長(zhǎng)在高鹽培養(yǎng)基上的菌落可出現(xiàn)自凝或假陽(yáng)性。

　19.2 葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)：用生理鹽水將血漿 4 倍稀釋，取 0.5ml。然后挑取 3～5 個(gè)菌落于稀釋血漿中，成濃菌懸液。置 37℃水浴，3～4h 后讀取結(jié)果，凝固者為陽(yáng)性。若陰性，繼續(xù)觀察到 24h，不凝固者為陰性。試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

　試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，應(yīng)見(jiàn)到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄

　球菌需要較長(zhǎng)時(shí)間孵育，才可出現(xiàn)陽(yáng)性。凝固酶試驗(yàn)應(yīng)考慮下述情況：

�、倌承┙瘘S色葡萄球菌產(chǎn)生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊。

�、谒�用血漿缺乏纖維蛋白原。

�、墼囼�(yàn)菌株不純。

　結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象判為陽(yáng)性；試管法以血漿凝固為陽(yáng)性。

　應(yīng)用：作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時(shí)常用的一個(gè)試驗(yàn)。

　20、新生霉素耐藥試驗(yàn) 方法：挑取待檢菌菌落數(shù)個(gè)，制成相當(dāng) 0.5 號(hào)麥?zhǔn)瞎?McFarland)濃度菌液，棉拭子浸透，擠去多余液，均勻涂在 M-H 平板上，貼上含 5ug／片的新生霉素紙片，35℃孵育 16～20h，抑菌環(huán)直徑≤16 為陽(yáng)性(耐藥)。試驗(yàn)時(shí)應(yīng)以金黃色葡萄球菌 ATCC25923 做陰性(敏感)對(duì)照，以確認(rèn)紙片是否有效。

　細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程

　一、細(xì)菌的接種 根據(jù)待檢標(biāo)本的來(lái)源、培養(yǎng)目的及所用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。

　l、平板畫線分離法 （1）、連續(xù)畫線分離法此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。用接種環(huán)取標(biāo)本少許，于平板 l/5 處密集涂布，然后回來(lái)作曲線連續(xù)劃線接種，線與線間有一定距離，劃滿平板為止。

�。�2）、分區(qū)畫線分離法此法適用于雜菌較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂布于平板邊緣一小區(qū) (約占平板 1/5)，再在二、三區(qū)依次連續(xù)畫線，每畫線一區(qū)均將接種針滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線 1～2 次。以獲得單個(gè)菌落。

　2、斜面接種法 該法主要用于單個(gè)菌落的純培養(yǎng)。用滅菌接種針取菌少許，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線畫線。一直畫到斜面頂端。

　3、液體接種法 多用于一些液體生化試驗(yàn)管的接種。用滅菌接種環(huán)取菌少許，在試管內(nèi)壁與液面交接處的管壁上輕輕研磨，使細(xì)菌混合于液體中。

　4、穿刺接種法 主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖鐵的接種。用接種針取菌少許，從半固體培養(yǎng)基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接觸管底，然后接種針原路退出。

　5、傾注平板法 臨床上主要用于尿液等標(biāo)本的細(xì)菌計(jì)數(shù)。將標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已經(jīng)溶化并冷卻至 45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。

　6、涂布接種法 常用于紙片藥物敏感性測(cè)定，也可用于被檢標(biāo)本的細(xì)菌計(jì)數(shù)。加定量的被

　檢菌液于瓊脂平板表面，然后用滅菌的棉簽反復(fù)涂布幾次，使被檢菌均勻分布在瓊脂平板表面。然后貼上藥敏紙片培養(yǎng)，或直接培養(yǎng)觀察結(jié)果。

　二、細(xì)菌培養(yǎng)方法 根據(jù)臨床初步診斷及待檢細(xì)菌的種類，可選用不同的環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)。常用的有需氧培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。

　1、需氧培養(yǎng)法 本法是臨床細(xì)菌室常用的培養(yǎng)方法，即將已經(jīng)接種好的平板、斜面和液體培養(yǎng)基等。置于 35℃溫箱中孵育 18～24 小時(shí)。

　2、二氧化碳培養(yǎng)法 本室用 CO 2 孵箱將已接種好的培養(yǎng)基置于 CO 2 孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

　三、分離及純化法 3.1、分離是指從原材料或多種細(xì)菌的混合培養(yǎng)物中將各種細(xì)菌彼此獨(dú)立地分離開(kāi)，以得到純的單一菌株，技術(shù)步驟如下：

　作純培養(yǎng)分離時(shí)，一般只用一只完整的瓊脂平板。涂劃多采用分區(qū)劃線法，在一只平板中可劃 3～5 個(gè)區(qū)。劃法有兩種：

　3.1.1、從臨床標(biāo)本分離細(xì)菌所含菌數(shù)相對(duì)較少時(shí)，可用接種環(huán)取標(biāo)本涂布在平板一角邊緣，然后從此區(qū)開(kāi)始劃線至 1／3 平板，為第一區(qū)，再在 2、3 區(qū)依次劃線，每劃完一個(gè)區(qū)域均將接種環(huán)滅菌一次，冷卻后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 1～2 次，使菌量逐漸減少以獲得單個(gè)菌落。

　3.1.2、快速劃線分離法：采用快速劃線使一接種環(huán)標(biāo)本能分離出單個(gè)菌落，這與標(biāo)本的菌量及操作者的技能有很大關(guān)系。

　3.2、純化是指欲獲得大量純培養(yǎng)物的方法，所用平板大小可根據(jù)需要的菌量而定。方法是將一單個(gè)菌落或?qū)⑾嗤�的菌落作大量密集涂劃于平板上而獲得大量純的培養(yǎng)物。

　支原體培養(yǎng)、鑒定 及藥敏 操作規(guī)程

　1．原理及依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：

　支原體分離鑒定培養(yǎng)基用于泌尿生殖道支原體(解脲支原體 Uu 和人型支原體 Mh)的檢測(cè)與診斷。當(dāng)有 Uu 和 Mh 生長(zhǎng)，分解尿素和精氨酸引起 PH 上升，使以酚紅為指示劑的培養(yǎng)基由黃轉(zhuǎn)紅。依據(jù)珠海迪爾生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書。

　2．標(biāo)本的采集：

　2.1、男性：用特別細(xì)的無(wú)菌棉拭子沾取無(wú)菌生理鹽水少許深入尿道口內(nèi) 2～2.5cm 處取分泌物，前列腺液亦可用沾取無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌棉拭子盡量多的沾取。

　2.2、女性：用沾取少許無(wú)菌生理鹽水的棉拭子取宮頸內(nèi)口 1～2cm 處單層柱狀上皮細(xì)胞，取樣拭子不可碰陰道壁。

　2.3、支原體對(duì)干、熱抵抗力差，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢。整個(gè)采樣過(guò)程應(yīng)注意無(wú)菌操作。

　3、標(biāo)本接種：(本實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免污染雜菌) 3.1、取出培養(yǎng)基，放置接近室溫，并在瓶蓋上編號(hào)。

　3.2、將采集的標(biāo)本拭子插入培養(yǎng)瓶中，在靠近液面上方的瓶壁擠示壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，使拭子中標(biāo)本滲入到肉湯中：若為液體標(biāo)本，取 200 u 1 加入培養(yǎng)基中；若為中段尿，經(jīng) 3000 轉(zhuǎn)／分離心 15 分鐘取沉渣 100ul 加入培養(yǎng)基中。

　3.3、蓋上瓶蓋，置 35～37℃孵箱，在 24～48 小時(shí)分別觀察結(jié)果。

　4、結(jié)果判讀：

　培養(yǎng)基變紅，判斷陽(yáng)性，培養(yǎng)基黃色并清亮，判斷陰性。

　5、已檢標(biāo)本處理：密閉容器高壓滅菌后，按醫(yī)用垃圾處理。

　血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、標(biāo)本采集 (1)、采集時(shí)間和次數(shù)血標(biāo)本一般應(yīng)在病人發(fā)熱初期或根據(jù)不同的發(fā)熱情況在未用抗生素前采集做細(xì)菌培養(yǎng)，提高陽(yáng)性率需連續(xù)三次采血進(jìn)行培養(yǎng)。

　(2)、采血部位及抽血量一般抽取肘靜脈血。采血量為成人 5~10ml，兒童為3～5ml。

　(3)、結(jié)果觀察：培養(yǎng) 72 小時(shí)后若肉眼或自動(dòng)血液培養(yǎng)儀報(bào)告仍未細(xì)菌生長(zhǎng)，則盲目移種一次，仍未細(xì)菌生長(zhǎng)，向臨床發(fā)出一級(jí)初級(jí)報(bào)告：“血液經(jīng) 72小時(shí)培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”，為避免漏診，應(yīng)在培養(yǎng) 5 天、7 天時(shí)再作盲目移種培養(yǎng)。疑為亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、真菌血癥等時(shí)，血培養(yǎng)至少連續(xù)培養(yǎng) 2～3 周，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)方可報(bào)告為陰性。

　2、檢驗(yàn)程序

　3、血培養(yǎng)瓶中不同表現(xiàn)為不同細(xì)菌生長(zhǎng)：

　渾濁并有凝無(wú)塊

　均勻渾濁，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣

　微渾濁，有綠色變化

　表面有菌膜，培養(yǎng)基清晰，底層容血

　表面有菌膜，膜下有綠色渾濁

　血細(xì)胞層上面有顆粒狀生長(zhǎng)，自上而下的溶血 金黃色葡萄球菌 多為革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌 枯草桿菌 銅綠假單胞菌 溶血性鏈球菌

　4、血液及骨髓標(biāo)本中常見(jiàn)病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌

　大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌

　傷寒及其它沙門菌 表皮葡萄球菌

　變形桿菌 溶血性鏈球菌

　產(chǎn)氣腸桿菌 糞腸球菌

　肺炎克雷伯氏菌 銅綠假單胞菌 糞產(chǎn)鹼桿菌 沙雷氏菌 流感嗜血桿菌 布魯氏菌 5、報(bào)告結(jié)果 血培養(yǎng)陽(yáng)性均作為危急值報(bào)告，所以血培養(yǎng)的結(jié)果應(yīng)及時(shí)通知臨床醫(yī)生，每日開(kāi)始工作可以首先檢查血培養(yǎng)，如有細(xì)菌生長(zhǎng)，立即處理。

　5.1、疑有細(xì)菌生長(zhǎng)者，經(jīng)涂片、革蘭氏染色、鏡檢后，電話通知主治醫(yī)生，報(bào)告“疑有革蘭氏××菌生長(zhǎng)”。并做藥敏試驗(yàn)，報(bào)告初步結(jié)果。

　5.2、經(jīng)分純培養(yǎng)完成鑒定及藥敏試驗(yàn)，發(fā)出報(bào)告。

　5.3、培養(yǎng) 7 天仍為陰性的標(biāo)本，報(bào)告無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

　臨床上診斷為亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎者，可持續(xù)培養(yǎng)至兩周再發(fā)陰性報(bào)告。

　中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　l、標(biāo)本采集

　以無(wú)菌方法采集腦脊液 2～5ml，盛于無(wú)菌瓶中送檢。

　2、直接檢查

　腦脊液可直接涂片、革蘭染色或抗酸染色等，然后鏡檢。無(wú)色透明的腦脊液，應(yīng)作離心取沉淀物涂片、染色鏡檢。

　3、檢驗(yàn)步驟：

　3.1、一般細(xì)菌涂片檢查除結(jié)核性腦膜炎外，由其它細(xì)菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液明顯混濁，可直接涂片，革蘭染色鏡檢。無(wú)色透明的腦脊液，應(yīng)離心后涂片、染色、鏡檢，根據(jù)染色及形態(tài)特征可初步提示細(xì)菌的種類。結(jié)核分枝桿菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物(3000r／min。30min)作抗酸染色。新型隱球菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負(fù)染色。

　3.2、分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取混濁腦脊液或經(jīng)離心沉淀的沉淀物，分別接種于血平板、巧克力平板，巧克力平板應(yīng)置于 CO 2 環(huán)境中 35℃培養(yǎng) 18～24 小時(shí)。腦脊液也可直接注入血培養(yǎng)瓶。

　4、檢驗(yàn)程序

　5、腦脊液培養(yǎng)常見(jiàn)病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　腦膜炎奈瑟菌

　 A、B 群鏈球菌

　 卡他布蘭漢菌

　 肺炎鏈球菌

　流感嗜血桿菌

　 結(jié)核分支桿菌

　腸桿菌科菌種

　 產(chǎn)單核李斯特菌

　腦膜敗血性黃桿菌

　 新型隱球菌

　假單胞菌

　 白色念珠菌 6、報(bào)告結(jié)果 無(wú)論是涂片還是培養(yǎng)，一但見(jiàn)到陽(yáng)性菌應(yīng)立即通知臨床醫(yī)師。培養(yǎng)并經(jīng)鑒定的結(jié)果報(bào)告“××菌”，同時(shí)報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

　下呼吸道感染病 原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、標(biāo)本的采集 有自然咳痰法、咽拭子采集法、支氣管鏡下采集法及分泌物標(biāo)本。

　2、標(biāo)本的直接檢查 (1)、將痰標(biāo)本涂片后待干，固定、染色，或直接濕片鏡檢，對(duì)病原學(xué)早期、初步診斷有重要意義。并向臨床發(fā)出初級(jí)報(bào)告。

　(2)、一般認(rèn)為合格的痰標(biāo)本為：以白細(xì)胞≥25 個(gè)/低倍鏡視野，而上皮細(xì)胞≤10 個(gè)/低倍鏡視野。采集合格標(biāo)本對(duì)細(xì)菌的診斷尤為重要。

　3、分離培養(yǎng)與鑒定 (1)、一般要求下呼吸道感染培養(yǎng)的細(xì)菌濃度應(yīng)>10 7 CFU/ml，可視為病原菌，<10 4 CFU/ml 可視為污染菌。若介于兩者之間 10 5 ～10 6 CFU／ml 時(shí)，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次以上仍為 10 5 ～10 6 CFU／ml 時(shí)，亦認(rèn)為是病原菌。

　(2)、檢驗(yàn)程序

　4、下呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)常見(jiàn)病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　 腦膜炎奈瑟氏菌

　 化膿性鏈球菌

　 流感嗜血桿菌

　 肺炎鏈球菌

　 腸桿菌科細(xì)菌

　 結(jié)核分支桿菌

　 非發(fā)酵菌

　 白喉棒狀桿菌

　 嗜肺軍團(tuán)菌

　 假絲酵母菌 5、報(bào)告結(jié)果 痰中的病原菌不少屬于機(jī)會(huì)致病菌，與正常菌群同時(shí)存在，報(bào)告時(shí)應(yīng)作說(shuō)明，未檢出致病菌時(shí)，應(yīng)報(bào)告“無(wú)致病細(xì)菌生長(zhǎng)”。

　尿路感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、尿液培養(yǎng)常見(jiàn)病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　淋病奈瑟菌

　 腸球菌

　大腸埃希菌

　 A 群鏈球菌

　變形桿菌

　 腐生葡萄球菌

　肺炎克雷伯菌

　 表皮葡萄球菌

　產(chǎn)氣腸桿菌

　 結(jié)核分支桿菌

　沙門菌種

　 銅綠假單胞菌

　 沙雷菌 2、標(biāo)本收集 2.1、尿液標(biāo)本的采集可采用多種方法：有中段尿采集法、膀胱穿刺法、腎盂尿采集法，而常規(guī)是取中段尿作細(xì)菌培養(yǎng)。

　2.2、取中段尿作培養(yǎng)時(shí)先要進(jìn)行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染標(biāo)本。

　2.3、如采用其他方法收集標(biāo)本，必須由臨床醫(yī)生根據(jù)臨床診斷需要而執(zhí)行收集術(shù)，并在檢驗(yàn)單上寫明。

　3、檢驗(yàn)步驟 3.1、涂片檢查 3.1.1、一般細(xì)菌及淋病奈瑟菌涂片：以無(wú)菌操作吸取尿液 10ml，3000r/min離心 15min，去上清液，取沉淀涂片，革蘭氏染色鏡檢，作初步報(bào)告。如查見(jiàn)革蘭氏陰性雙球菌，呈腎形位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，報(bào)告“找到革蘭陰性雙球菌，存在于細(xì)胞內(nèi)外，形似淋病奈瑟菌”。如未查見(jiàn)上述細(xì)菌可報(bào)告“未發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌”。

　3.1.2、念珠菌涂片：取尿液沉淀物放于清潔玻片上，覆以蓋玻片，制成涂片，用高倍鏡檢查。革蘭染色后，如發(fā)現(xiàn)發(fā)亮的芽生孢子和假菌絲，就可報(bào)告“霉菌孢子及菌絲”。

　3.1.3、結(jié)核分枝桿菌：取尿液 10ml，4000r/min 離心 30min，取沉淀物涂片，抗酸染色，鏡檢。如找到紅色桿菌，可報(bào)告“查到抗酸桿菌”。

　3.2、一般細(xì)菌培養(yǎng)(細(xì)菌計(jì)數(shù))：用定量接種環(huán)取尿液 10 u l 接種血平板，35℃培養(yǎng) 18～24 小時(shí)，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，并計(jì)數(shù)菌落數(shù)，乘以 1000，求出每毫升尿液的菌落數(shù)。根據(jù)菌落特征、涂片染色結(jié)果，進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，如培養(yǎng) 48 小時(shí)無(wú)菌生長(zhǎng)，即報(bào)告“無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”。

　3.3、特殊菌培養(yǎng)：淋病奈瑟菌培養(yǎng)，選用專用巧克力瓊脂平板，接種后放入二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。

　4、檢驗(yàn)程序

　5、結(jié)果報(bào)告：

　5.1、尿液細(xì)菌培養(yǎng)檢查必須報(bào)告細(xì)菌的種屬、菌落計(jì)數(shù)(cfu/m1)及藥敏結(jié)果。

　5.2、革蘭氏陰性菌落計(jì)數(shù)大于 10 5 cfu/ml，革蘭氏陽(yáng)性菌計(jì)數(shù)大于 10 4 cfu/ml，真菌大于 10 3 cfu/ml 有診斷意義。

　5.3、一般常規(guī)結(jié)核培養(yǎng)要 8 周方能報(bào)告。陽(yáng)性結(jié)果可提前報(bào)告。但不做菌落計(jì)數(shù)只報(bào)告“抗酸桿菌生長(zhǎng)”的報(bào)告，如做了進(jìn)一步的分型和鑒定，才能報(bào)

　告“有××型結(jié)核桿菌生長(zhǎng)”。

　5.4、用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)淋球菌經(jīng)鑒定可直接報(bào)告“有淋球菌生長(zhǎng)”但不做菌落計(jì)數(shù)，如涂片發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)或外有革蘭氏陰性雙球菌可報(bào)告“發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌”。

　5.5、如尿液培養(yǎng)同時(shí)有三種或以上細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，可視為污染標(biāo)本，建議重留送檢。

　消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、糞便標(biāo)本中常見(jiàn)病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　 傷寒及其它沙門菌 結(jié)核分支桿菌

　 志賀菌屬 難辨梭菌

　 致病大腸埃希菌 白色念珠菌

　 (ETEC、EPEC、EIEC、EHEC) 弧菌屬菌種 氣單胞、鄰單胞菌種 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 彎曲菌 2、標(biāo)本采集 2.1、自然排便采集法：自然排便后，挑取膿血、粘膜部分的糞便 2～3g，液體糞便取絮狀物置于大便培養(yǎng)管或增菌液中送檢。

　2.2、直腸肛管法：用大便培養(yǎng)用的肛管直接插入肛門成人 4～5cm，幼兒 2～3cm，輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)數(shù)次，目的是使直腸表面粘液能通過(guò)肛管孔進(jìn)入肛管內(nèi)。然后拔出放入大便培養(yǎng)管中送檢。

　3、檢驗(yàn)步驟 3.1、涂片檢查糞便標(biāo)本因各種正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有懷疑霍亂弧菌及菌群失調(diào)所致腹瀉時(shí)，才作直接涂片檢查。

　3.2、各項(xiàng)的涂片檢驗(yàn)均按染色方法進(jìn)行，但大便檢查霍亂弧菌的處理程序：

　3.2.1、染色檢查：將米泔樣的標(biāo)本涂 2 張片用乙醇固定后染色，觀察弧菌有無(wú)呈魚群狀排列。

　3.2.2 懸滴檢查：取患者糞便制成懸滴涂片，霍亂弧菌古典型和 EL-Tor 型均呈現(xiàn)極活潑的穿梭狀運(yùn)動(dòng)。

　3.2.3 制動(dòng)檢驗(yàn)：運(yùn)動(dòng)活潑的弧菌涂片加人霍亂弧菌診斷血清后，在顯微鏡下觀察，若原運(yùn)動(dòng)活潑的現(xiàn)象停止，為制動(dòng)試驗(yàn)陽(yáng)性。

　3.3、大便標(biāo)本的培養(yǎng)目的是培養(yǎng)致病菌或追蹤病人有否菌群失調(diào)現(xiàn)象，無(wú)

　特殊要求作一般致病菌培養(yǎng)的標(biāo)本接種麥康凱、SS 平板各一個(gè)。

　3.4、菌群失調(diào)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)：選用多種培養(yǎng)基包括 SS、麥康凱、血平板、高鹽甘露醇鹽瓊脂平板、Campy-BA 血瓊脂平板和沙氏瓊脂等，目的是使更多的菌群得到生長(zhǎng)，以利于檢查腸道的細(xì)菌情況。

　3.5、霍亂弧菌的培養(yǎng)：直接取患者米泔樣糞便 0.5ml，接種于堿性蛋白胨水增菌液和 4 號(hào)平板，35℃培養(yǎng) 6～8h，再轉(zhuǎn)種一只 4 號(hào)平板。35 ℃培養(yǎng) 18～24h 后形成較大、菌落中間為灰黑色、有光澤、隆起、濕潤(rùn)的菌落，如潑水狀。挑取可疑菌落 5～10 個(gè)與霍亂多價(jià)“O”血清作凝集試驗(yàn)。

　診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)，如為陽(yáng)性，則立即報(bào)告，并將可疑菌送疾病控制中心確認(rèn)。

　3.6、真菌培養(yǎng)：真菌性腹瀉多繼發(fā)于抗生素治療后，常見(jiàn)的真菌腹瀉多由白色假絲酵母菌引起。將標(biāo)本接種于沙氏平板及血平板上，置 27℃和 35℃培養(yǎng)18～24h，根據(jù)形態(tài)染色、菌落特征，做真菌鑒定和藥敏試驗(yàn)。

　4、檢驗(yàn)程序

　5、結(jié)果報(bào)告 糞便培養(yǎng)的報(bào)告方式應(yīng)以分離目的菌種的結(jié)果而定，如：目前常規(guī)以 SS 培養(yǎng)基分離糞便中的致病菌，陽(yáng)性者應(yīng)報(bào)告“檢出沙門菌或檢出志賀菌”，陰性者報(bào)告“未檢出沙門菌或未檢出志賀菌”。其他培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告方式與上述原則相同。

　膿汁及病灶分泌物細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、膿汁及病灶分泌物培養(yǎng)常見(jiàn)病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　革蘭陰性菌 葡萄球菌

　腸桿菌科細(xì)菌

　 鏈球菌

　假單胞菌

　 炭疽芽孢桿菌

　擬桿菌

　 破傷風(fēng)芽孢桿菌

　腐敗謝瓦納拉菌

　 產(chǎn)氣莢膜梭菌

　嗜血桿菌

　 結(jié)核分枝桿菌

　產(chǎn)堿桿菌

　 放線菌、奴卡菌

　弧菌屬細(xì)菌

　 念珠菌

　氣單胞菌 2、標(biāo)本采集：標(biāo)本由臨床醫(yī)師行無(wú)菌操作術(shù)采集，但應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

　2.l、閉鎖性膿腫疑為厭氧菌感染時(shí)，取材后立即將空氣排空，同時(shí)針尖插入橡皮塞內(nèi)防止空氣進(jìn)入，連同注射器一并送檢。

　2.2、開(kāi)放膿腫、膿性分泌物可在患部直接用棉拭或紗布擦抹，如為瘺管亦可在無(wú)菌操作下取組織碎片分散在無(wú)菌鹽水中。

　2.3、燒傷創(chuàng)面的分泌物，用滅菌棉拭取多部位創(chuàng)面的膿液或分泌物，置無(wú)菌試管中送檢。

　2.4、取尿道分泌物必須先清洗、消毒尿道后用擠壓法使分泌物從尿道溢出，用無(wú)菌生理鹽水浸濕拭子直接采集標(biāo)本。如女性做宮頸分泌物細(xì)菌培養(yǎng)，應(yīng)盡量避免雜菌污染。

　2.5、組織臟器碎片的收集，先要消毒表面的污染菌，后用無(wú)菌刀切開(kāi)，取內(nèi)容物及碎片分散于無(wú)菌生理鹽水中，然后增菌、接種，如活體微量標(biāo)本可直接放人肉湯增菌培養(yǎng)基中增菌。

　3、檢驗(yàn)步驟 3.1、涂片檢查：膿汁及分泌物標(biāo)本均應(yīng)做涂片檢查。涂片做革蘭氏染色鏡檢，根據(jù)形態(tài)和染色特點(diǎn)，可報(bào)告“找到革蘭氏×性菌，形似××菌”或報(bào)告“未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌”。涂片檢查包括涂片找細(xì)菌、淋球菌、酵母菌等。

　3.2、培養(yǎng) 普通細(xì)菌培養(yǎng)：標(biāo)本接種血平板、麥康凱平板各一只，35℃培養(yǎng) 18～24 小時(shí)，根據(jù)菌落特性和形態(tài)染色，進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，如培養(yǎng) 48 小時(shí)無(wú)菌生長(zhǎng)，即報(bào)告“無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”。

　4、報(bào)告結(jié)果 4.1、涂片報(bào)告“找到革蘭氏×性菌”，淋球菌要報(bào)告在白細(xì)胞內(nèi)外是否發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌。

　4.2、對(duì)正常無(wú)菌部位的感染，從膿汁或分泌物分離到細(xì)菌，均有臨床意義，按分離鑒定結(jié)果報(bào)告細(xì)菌名稱及藥敏試驗(yàn)。

　5、操作流程

　生殖系統(tǒng)標(biāo)本的處理

　1、生殖系統(tǒng)標(biāo)本培養(yǎng)的主要病原菌 革蘭陽(yáng)性菌

　 革蘭陰性菌 葡萄球菌

　 淋病奈瑟菌 腸球菌

　 大腸埃希菌 化膿性鏈球菌

　 擬桿菌 厭氧鏈球菌

　 銅綠假單胞菌 結(jié)核分枝桿菌

　 變形桿菌 2、標(biāo)本收集：陰道、子宮頸及前列腺等分泌物應(yīng)由臨床醫(yī)師采集，收集于無(wú)菌試管內(nèi)送檢。

　3、涂片檢查 3.1、一般細(xì)菌、淋病奈瑟菌和杜克雷嗜血桿菌：革蘭染色鏡檢作初步報(bào)告。

　3.2、結(jié)核桿菌：抗酸染色鏡檢后作初步報(bào)告。

　4、檢驗(yàn)過(guò)程：用棉拭子劃完第一區(qū)后，用接種環(huán)繼續(xù)分區(qū)劃線，35℃普通培養(yǎng)箱孵育 18～24 小時(shí)，如有要求培養(yǎng)淋球菌和真菌則加種專用培養(yǎng)基。

　5、檢驗(yàn)流程

　 6、結(jié)果報(bào)告：報(bào)告細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

　抗菌藥物敏感試驗(yàn)

　若只根據(jù)是否出現(xiàn)抑菌環(huán)而不考慮抑菌環(huán)的直徑大小，來(lái)判斷細(xì)菌是否對(duì)抗菌藥物敏感的實(shí)驗(yàn)方法，其結(jié)果是不正確的。而紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)原理，根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小與最低抑菌濃度的相關(guān)性，結(jié)合臨床上已知敏感或耐藥菌株的狀態(tài)，其結(jié)果是可靠的。WHO 推薦瓊脂擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)(改良 Kirby-Bauer 法)，簡(jiǎn)稱 K-B 法，其目的在于技術(shù)的簡(jiǎn)單和可重復(fù)性。本法特別適用于腸桿菌科細(xì)菌，也可用于快速生長(zhǎng)的致病菌，但不適用于其他細(xì)菌，如嗜血桿菌、奈瑟菌、專性厭氧菌及酵母樣菌等。無(wú)論用哪種方法接種，只要質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)在預(yù)期范圍內(nèi)，均可按同一解釋標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果。但并非從感染患者分離到的微生物都必須做敏感試驗(yàn)，對(duì)于污染、機(jī)體共生的正常細(xì)菌群和那些與感染無(wú)關(guān)的細(xì)菌，可不必做敏感試驗(yàn)，只有那些被認(rèn)為引起感染的微生物，應(yīng)先分純、鑒定菌種后再做敏感試驗(yàn)。

　1、試驗(yàn)用材料 1.1、培養(yǎng)基 Kirby-Bauer 法指定用 Mueller-Hinton 瓊脂。多年大量的有關(guān)敏感試驗(yàn)的方法學(xué)研究，均采用該培養(yǎng)基，維持細(xì)菌正常發(fā)育，絕大多數(shù)細(xì)菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。此培養(yǎng)基不拮抗抗菌藥物活性以及商品的批間差異等方面均優(yōu)于其他培養(yǎng)基。若檢測(cè)肺炎鏈球菌的敏感性時(shí)，在培養(yǎng)基中加 5％的脫纖維羊血，制成血平板。測(cè)嗜血桿菌及淋病奈瑟菌的敏感性時(shí)，在培養(yǎng)基中須加入 1％血紅素和 2.5mg/ml 輔酶 I 后應(yīng)校正 pH 7.2～7.4。

　制備 MH 瓊脂平板應(yīng)用直徑 90cm 平皿。在水平的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上傾制。瓊脂厚為 4mm，允許誤差為土 lmm。瓊脂凝固后，應(yīng)測(cè)一下 pH 是否正確。瓊脂于板應(yīng)放 4℃保存，在 7 日內(nèi)用完。

　1.2、藥物紙片 抗菌藥物紙片直徑約為 6.00～6.35mm，每片的吸水量約 20μl。采用 K-B法，紙片的藥物含量必須與該法規(guī)定的一致，不得任意更改。藥物紙片可以購(gòu)買，也可自制，用前必須做質(zhì)量鑒定。用以下兩個(gè)指標(biāo)判定紙片的質(zhì)量：

　①片間差：是衡量不同紙片含藥是否均一的指標(biāo)。測(cè)定方法：以質(zhì)控菌株

　接種 M-H 瓊脂平板，一塊平板上貼 6 張相同的紙片。

　35C 過(guò)夜，培養(yǎng)后，記錄 6 個(gè)抑菌直徑，其最大和最小之差不應(yīng)大于 1～2mm。

�、跍�(zhǔn)確度：判定紙片的實(shí)際含藥量與標(biāo)量是否一致。

　紙片的合理保存十分重要。藥物紙片必須...

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